王 雨， 黃曉嵐， 張楚晗， 曲星伊， 郭晨雪， 陳 焰， 范亞新， 郭蓓寧， 張 菁， 劉笑芬

多黏菌素B是治療廣泛耐藥革蘭陰性菌的最后一道防線。腎毒性是多黏菌素B的主要不良反應(yīng)，發(fā)生率高（38%），臨床應(yīng)用被限制[1]。多黏菌素類藥物合理應(yīng)用國際指南中指出，多黏菌素B穩(wěn)態(tài)血藥濃度在2～4 mg/L，體內(nèi)暴露量藥時曲線下面積（AUC）在50～100 mg·h/L范圍內(nèi)有較好的療效，超上限時，則會明顯增加毒性發(fā)生風(fēng)險[2]。多黏菌素類藥物治療窗窄，腎毒性發(fā)生率高，個體差異大，推薦進(jìn)行治療藥物監(jiān)測（TDM），指導(dǎo)臨床合理用藥，對于提高療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率、減緩耐藥具有重要意義[3]。

TDM的實施需要生物樣本分析方法的支持。多黏菌素B作為30多種成分組成的混合物，且無發(fā)光基團(tuán)，為分析方法的建立帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。早期，多黏菌素B的分析方法有毛細(xì)管電泳、薄層色譜、高效液相色譜-紫外檢測/熒光檢測(HPLC-UV/FD)等[4-7]，但靈敏度低、特異性差，且耗時。近年來，靈敏度高、特異性好且高效的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法常用于多黏菌素B濃度測定。Cheng等[8]對大鼠血樣采用三氯乙酸(TCA)進(jìn)行蛋白沉淀并作為離子對試劑，但缺少基質(zhì)效應(yīng)考察。Thomas等[9]將建立的LC-MS/MS法成功用于患者血樣中多黏菌素B1和B2測定，但線性范圍窄（0.1～2.5 mg/L），且溶血和脂血會干擾目標(biāo)物的測定。Covelli等[10]開發(fā)的LC-MS/MS法可測定不同基質(zhì)中（陽離子調(diào)節(jié)肉湯、人及大鼠血漿）的多黏菌素B1和B2，但分析時間較長（20 min）。Meng等[11]和Hee等[12]開發(fā)的LC-MS/MS法可同時測定至少3種多黏菌素B的組分（B1/B2/B1-Ile/B3）， 并將分析時間縮短至5.5～6.5 min，但前者以TCA作為離子對試劑被添加至流動相和處理樣品，后者則采用復(fù)雜且昂貴的固相萃取法處理樣品。Liu等[13]將分析時間縮短至3 min，且可同時測定人血漿和尿液中的多黏菌素B1和B2，并在尿液中添加0.1%～1%牛血清蛋白來避免多黏菌素B的非特異性吸附，但使用了復(fù)雜且昂貴的固相萃取法，不利于TDM的常規(guī)開展。鄧陽等[14]采用乙腈對血樣進(jìn)行蛋白沉淀處理，并擴(kuò)大線性范圍（B1：0.033～18.816 mg/L，B2：0.034～19. 872 mg/L），但分析時間（10 min）相對較長。

為此本研究在實驗室前期已發(fā)表的多黏菌素B分析方法[13]基礎(chǔ)上優(yōu)化預(yù)處理方法、色譜條件、線性范圍等，獲得一種快速、簡便、靈敏度及準(zhǔn)確度高的LC-MS/MS法同時測定人血漿中的多黏菌素B1（含B1-l）和B2，且根據(jù)9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則（《中華人民共和國藥典》）[15]進(jìn)行方法學(xué)驗證，并應(yīng)用于多黏菌素B在臨床上的TDM。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

多黏菌素B，其中B1含量為73.4%，B1-l含量為8.6%， B2含量為9.0%，批號為R046V0，購自USP（United States Pharmacopeial Convention，Inc.）；多黏菌素E2含量為100%，來源于上藥第一生化研究所；乙腈（德國默克公司）為色譜純；甲酸（德國Sigma-Aldrich 公司）為分析純；超純水由法國Millipore超純水系統(tǒng)制備；2 mL 96孔收集板購自美國Waters公司?？瞻籽獫{留取經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2019臨審第310號），為EDTA-K2抗凝。

1.2 儀器

液相色譜系統(tǒng)為HPLC高效色譜，美國AB SCIEX公司；質(zhì)譜系統(tǒng)為API 4500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（ESI源），美國AB SCIEX公司；Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)采集軟件，美 國AB SCIEX公 司；Mettler Todelo XS 205電子分析天平，瑞士梅特勒公司；控溫高速離心機(jī)（LEGEND MICRO 17R），德 國Thermo Fisher公司；－70℃低溫冰箱（Thermo Forma 900），美國Thermo Fisher公司。

1.3 液相及質(zhì)譜條件

色譜柱選用PhonomenexKinetex XB-C18柱（100mm×2.1 mm I.D.， 2.6 μm），且 柱 溫 為（40.0±5.0）℃；流動相由0.2%甲酸-乙腈（A相）和0.2%甲酸水溶液（B相）組成，且流速為0.4 mL/min；自動進(jìn)樣器設(shè)定溫度為（10.0±5.0）℃；進(jìn)樣量為5.0 μL；梯度洗脫，如下：0～2.5 min，10%升 至35%A相；2.5～2.9 min，35%A升 至70%A；2.9～3.0 min，70%A降至10%A；3.0～3.5 min，維持10%A。

電噴霧電離源(ESI)；正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；多黏菌素B1、B2和多黏菌素E2的離子對分別為m/z 602.6→m/z 241.1、m/z 595.5→m/z 227.1和m/z 578.5→m/z 101.2；三個化合物的掃描時間、去簇電壓及碰撞能量相同，分別為200 ms、80V、23V。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品和內(nèi)標(biāo)工作溶液配制

精密稱量多黏菌素B對照品兩份，分別加0.2%甲酸水配制B1（含B1-l）濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控儲備液。將標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控儲備液用0.2%甲酸水稀釋至一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控系列工作溶液，再用空白血漿樣品分別稀釋20倍后獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品多黏菌素B1（含B1-l）/B2濃度分別為0.050 0/0.005 49、0.100/0.011 0、0.200/0.022 0、0.400/0.043 9、0.800/0.087 8、1.25/0.137、2.50/0.274、5.00/0.549、10.00/1.098 mg/L。質(zhì)控樣品濃度分別為0.150/0.016 5、0.800/0.087 8、8.00/0.878 mg/L。

另外精密稱量多黏菌素E2對照品，加0.2%甲酸水配制成10 000 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，再以0.2%甲酸水稀釋，獲得濃度為5.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)（IS）工作溶液。

1.5 血漿樣品預(yù)處理

精密吸取100 μL血漿樣品到2 mL EP管中加入50 μL IS工作溶液，再加入6%甲酸水50 μL渦旋混勻，再加入300 μL乙腈渦旋混勻。12 000 r/min、4℃離心10 min后吸取上清液200 μL至96孔板中，再加入300 μL 6%甲酸水，混勻，進(jìn)樣5 μL。

1.6 方法學(xué)考察

分別對來源于3個不同健康志愿者和3個不同老年肺炎患者的空白血漿樣品進(jìn)行選擇性考察。與LLOQ樣品的出峰位置以及峰面積比較，觀察空白血樣是否在待測物及內(nèi)標(biāo)出峰處存在干擾。多黏菌素B1（含B1-l）/B2標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品的濃度分別是0.050 0/0.005 49、0.100/0.011 0、0.200/0.022 0、

0.400/0.043 9、0.800/0.087 8、1.25/0.137、2.50/0.274、5.00/0.549、10.00/1.098 mg/L。多黏菌素B1/B2血漿的LLOQ濃度為0.050 0/0.005 49 mg/L。以血漿多黏菌素B1/B2濃度為橫坐標(biāo)（x），多黏菌素B1/B2峰面積與內(nèi)標(biāo)多黏菌素E1峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），用加權(quán)（W = 1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運算，相關(guān)系數(shù)為R2。另配制多黏菌素B 的LLOQ和質(zhì)控樣品，在同一批次內(nèi)每個濃度重復(fù)6樣本，在至少2 d內(nèi)連續(xù)測定3個批次，分別計算批內(nèi)和批間精密度[用變異系數(shù)（CV）表示]和準(zhǔn)確度 （RE）。

考察健康者空白血漿、患者空白血漿、溶血、脂血及患者血清等不同基質(zhì)對多黏菌素B及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的影響以及提取回收率。處理6個不同來源的空白血漿（3份正?？瞻籽獫{和3份患者空白血漿）、1份空白溶血、1份空白脂血及3份患者血清，離心后的上清液與6%甲酸水按2∶3混合后，分別加入低、中、高濃度的質(zhì)控工作溶液和IS工作溶液，混勻后即得空白基質(zhì)含藥溶液。將以上低、中、高濃度的質(zhì)控工作溶液和IS工作溶液用6%甲酸與乙腈的混合溶液稀釋至相同濃度，即得含藥溶液。分別計算低、中、高濃度下的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子（待測物峰面積比值/內(nèi)標(biāo)峰面積比值×100%，其中峰面積比=空白基質(zhì)含藥溶液峰面積/含藥溶液峰面積）。另用混合空白血漿配制低、中和高濃度的質(zhì)控樣品，各平行處理6份，同時配制混合空白血漿處理后添加含藥溶液樣品（6份）。分別計算多黏菌素B低、中、高濃度下的提取回收率[提取回收率=質(zhì)控樣品處理后待測物的面積/混合空白基質(zhì)處理后加含藥溶液面積平均值×100% （n=6）]?；|(zhì)效應(yīng)和提取回收率分別計算變異系數(shù)，要求＜15.0%。

1.7 TDM的臨床應(yīng)用

我們開展了廣泛耐藥革蘭陰性菌感染患者（包含兒童和老年）中多黏菌素B TDM等臨床研究，并均已通過復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2020臨審第668號；2020臨審第847號；2020臨審第831號修正1）。應(yīng)用多黏菌素 B 治療的患者在藥物達(dá)穩(wěn)態(tài)（一般第4劑及以后）用藥前和結(jié)束后 0.5 h內(nèi)分別采集其谷、峰血樣；若多黏菌素 B 給藥方案需進(jìn)行調(diào)整，于調(diào)整后第 2～3劑靜脈滴注前和靜脈滴注結(jié)束后 0.5 h內(nèi)采集谷濃度和峰濃度樣品。采血管為紫帽管（EDTA K2抗凝），采集1～2 mL全血，在3 500 r/min 4℃下離心10 min，取全部上清液于血樣保存管，于-70 ℃冷凍保存至檢測。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

3個不同健康者和3個不同患者的空白血漿及混合空白血漿在多黏菌素B1、B2和內(nèi)標(biāo)出峰處均未見干擾峰，表明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)化合物的測定。LLOQ樣品中多黏菌素B1、B2和內(nèi)標(biāo)峰形對稱，分離良好，保留時間分別為2.02、1.86、1.72 min（圖1和圖2）。血漿樣品中的多黏菌素B1和B2分別在0.05～10.0 mg/L和0.005 49～1.098 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。典型標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：多黏菌素B1，y= 0.984x－0.002 29 （R2= 0.996 8）；多黏菌素B2，y= 2.45x＋ 0.001 1 （R2= 0.989 2）。

圖1 多黏菌素B1和內(nèi)標(biāo)典型血漿色譜圖Figure 1 Representative chromatograms of polymyxin B1 （PMB1） and internal standards （PME2） in blank human plasma

圖2 多黏菌素B2和內(nèi)標(biāo)典型血漿色譜Figure 2 Representative chromatograms of polymyxin B2 （PMB2） and internal standards （PME2） in blank human plasma

準(zhǔn)確度與精密度數(shù)據(jù)見表1。多黏菌素B1 LLOQ樣品批內(nèi)、批間精密度分別為13.1%和15.4%，準(zhǔn)確度分別為117.7%和106.6% 。多黏菌素B1的質(zhì)控（低、中、高濃度）樣品批內(nèi)精密度均≤5.9%，批間精密度均≤14.0%，準(zhǔn)確度在100.9%～110.8%范圍內(nèi)。多黏菌素B2 LLOQ樣品批內(nèi)批間精密度分別為16.0%和19.3%，準(zhǔn)確度分別為107.0%和91.6%。多黏菌素B2的質(zhì)控（低、中、高濃度）樣品批內(nèi)精密度均≤10.6%，批間精密度均≤14.8%，準(zhǔn)確度在97.6%～100.7%范圍內(nèi)以上結(jié)果均符合生物樣本測定相關(guān)要求[15-17]。

表1 血漿中多黏菌素B1、B2的批間及批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度Table 1 Accuracy and precision for polymyxin B1 and B2 assay in human plasma

多黏菌素B1健康者和患者血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為92.6%～103.0%；溶血血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為102.4%～112.6%；脂血血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為99.9%～104.7%；患者血清內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為97.1%～106.3%。多黏菌素B2健康者和患者血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為73.6%～94.6%；溶血血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為85.6%～120.6%；脂血血漿內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為89.7%～103.4%；患者血清內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為82.6%～93.4%。以上所有的精密度均＜15.0%。結(jié)果表明，在本研究中可忽略基質(zhì)效應(yīng)對待測物及其內(nèi)標(biāo)的影響（表2）。血漿樣品中多黏菌素B1和B2的提取回收率分為79.1%～80.6%和83.2%～87.8%，精密度≤14.6%。

表2 多黏菌素B1/B2在血漿中基質(zhì)效應(yīng)和回收率Table 2 The extraction recovery and internal standard normalized matrix effect of polymyxin B1 and B2 in human plasma（%）

2.2 TDM

采用本研究所建立的方法，對臨床55例感染患者進(jìn)行多黏菌素B用藥后TDM，其中包括中青年患者20例、老年患者（65歲以上）20例，兒童患者（18 d～14歲）15例，中青年、老年患者和兒童患者的給藥劑量分別為50～75 mg、40～75 mg和0.88～2.22 mg/kg每12小時1次。多黏菌素B在中青年、老年和兒童患者中的血藥濃度分布見圖3。

圖3 多黏菌素B在中青年、老年與兒童患者中的血藥濃度Figure 3 The trough and peak plasma concentrations following different doses of polymyxin B in adult， elderly and pediatric patients

3 討論

本實驗室前期建立了LC-MS/MS法同時測定人血漿和尿液中的多黏菌素B1和B2濃度，應(yīng)用于多黏菌素B臨床藥動學(xué)研究和TDM[13]。樣品預(yù)處理方法采用固相萃取法，操作相對復(fù)雜，且成本高，不利于廣泛開展多黏菌素B的TDM[11]。有報道采用TCA作為沉淀劑處理生物樣品，但會影響目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信號且腐蝕性強(qiáng)，較危險。本研究對樣本預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，選用乙腈作為沉淀劑，操作簡單且成本低。

在離子對的選擇上，多黏菌素B的主要成分多黏菌素B1、B2，在LC-MS/MS中可以監(jiān)測到［M + 2H］2+及［M + 3H］3+母離子，其中帶三電荷母離子的離子對響應(yīng)更高，可以根據(jù)靈敏度需求選擇合適的離子對進(jìn)行測定[14]。在方法開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)帶三電荷離子通道的干擾峰明顯，需要較長分析時間將其色譜分離，因此本方法采用帶雙電荷離子進(jìn)行定量分析。內(nèi)標(biāo)的選擇在LC-MS/MS方法的建立中非常重要，通常同位素內(nèi)標(biāo)是LCMS/MS方法的首選，然而鑒于多黏菌素B的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成同位素內(nèi)標(biāo)價格昂貴，因而可選擇其結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標(biāo)[18]。多黏菌素E作為多黏菌素B的結(jié)構(gòu)類似物，在性質(zhì)上與多黏菌素B相似，其純品多黏菌素E1或多黏菌素E2均可以作為內(nèi)標(biāo)[10，13]。多黏菌素E的混合物不推薦作為內(nèi)標(biāo)，其成分復(fù)雜會在質(zhì)譜中產(chǎn)生離子通道間交互影響，干擾多黏菌素B的測定，對色譜條件要求較高。

相比于樣品處理更干凈的固相萃取法，蛋白沉淀法需注意在檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)的影響。由于建立方法的過程中通常采用健康受試者血清或血漿，而臨床患者血樣通常由于疾病、用藥等影響，血樣測定過程中可能帶來基質(zhì)效應(yīng)影響[19-20]。本方法在進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察時，為模擬真實樣品，除健康者空白血漿樣品、溶血以及脂血樣品外，還增加3個不同來源臨床患者的空白血漿樣品?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示，臨床患者血漿樣本中內(nèi)源性物質(zhì)及合并用藥不干擾多黏菌素B的質(zhì)譜響應(yīng)。同時，在臨床采集多黏菌素B的TDM血樣時，臨床可能易錯用為促凝劑管。本研究還選用3個不同來源臨床患者的空白血清樣品，考察其對多黏菌素B質(zhì)譜信號的影響。血清樣品基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果表明，本方法可直接用于人血清樣品中的多黏菌素B濃度測定，與鄧陽等[14]報道的結(jié)果一致。

多黏菌素B純水溶液在LC-MS/MS測定過程中發(fā)現(xiàn)會吸附在玻璃或塑料制品壁上，導(dǎo)致方法建立或者測定不準(zhǔn)確。通常在純水溶液中加入一定比例的表面活性劑、有機(jī)溶劑、酸或蛋白溶液，都能夠有效預(yù)防吸附的發(fā)生[11，13]。所以，本方法不可直接用于測定蛋白質(zhì)少的基質(zhì)樣品，如腦脊液、尿液、肺泡灌洗液，需提前添加防吸附劑來確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究建立了一種簡單、快速、靈敏度高和準(zhǔn)確性好的LC-MS/MS法，用于人血漿中多黏菌素B中主要成分B1和B2濃度的測定，可為該藥在患者包括成人、老年及兒童患者中的TDM提供簡單、快速檢測方法。