劉萬(wàn)路

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿mPEG-PLGA納米粒處方制備工藝及其藥動(dòng)學(xué)研究

劉萬(wàn)路

威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264300

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid，mPEG-PLGA）納米粒［chelerythrine mPEG-PLGA nanoparticles，Che@mPEG-PLGA/NPs］處方，并對(duì)最佳處方進(jìn)行體外評(píng)價(jià)及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。納米沉淀法制備Che@mPEG-PLGA/NPs，以包封率、載藥量和粒徑為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩選Che@mPEG-PLGA/NPs的最佳處方。將Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液進(jìn)一步制備成凍干粉，并考察凍干粉的穩(wěn)定性和體外釋藥行為。SD大鼠分為Che原料藥組、物理混合物組和Che@mPEG-PLGA/NPs組，分別按20 mg/kg劑量ig后采血，HPLC法測(cè)定血藥濃度，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及相對(duì)生物利用度。Che@mPEG-PLGA/NPs最佳處方為mPEG-PLGA用量572 mg、水相與有機(jī)相的體積比為2.3∶1、泊洛沙姆188用量為1.2%。Che@mPEG-PLGA/NPs的包封率為（83.49±1.59）%，載藥量為（4.61±0.14）%，粒徑為（163.93±8.02）nm。Che@mPEG-PLGA/NPs在不同pH值釋藥介質(zhì)中的體外釋藥具有明顯的緩釋特征。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，Che@mPEG-PLGA/NPs的達(dá)峰時(shí)間（max）延后至（2.12±0.46）h，半衰期（1/2）延長(zhǎng)至（5.66±0.93）h，達(dá)峰濃度（max）增加至4.49倍，相對(duì)口服吸收生物利用度提高至4.66倍。Che@mPEG-PLGA/NPs可顯著提高Che的口服吸收生物利用度，值得進(jìn)一步研究。

白屈菜紅堿；mPEG-PLGA；納米粒；Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；緩釋；藥動(dòng)學(xué)；口服生物利用度；納米沉淀法

白屈菜紅堿（chelerythrine，Che）屬于異喹啉類苯并菲啶型生物堿，主要存在于白屈菜、博落回等中藥植物根莖中[1]，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、改善肝功能、消炎、抑菌等活性[1-3]，且毒性極低[1]。另?yè)?jù)研究結(jié)果顯示[4]，Che可以通過(guò)調(diào)節(jié)SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵信號(hào)通路，來(lái)防止過(guò)度炎癥性免疫反應(yīng)，且本身獨(dú)特的抗病毒機(jī)制，使其非常有潛力成為治療新型冠狀病毒的候選藥物之一，開(kāi)發(fā)價(jià)值較高。經(jīng)測(cè)定，Che在25 ℃下水中溶解度為（91.28±0.31）μg/mL，半衰期為（2.49±0.49）h[5]，存在一定的首關(guān)效應(yīng)[6]，導(dǎo)致口服吸收生物利用度較低（僅為13.29%）[7]，臨床應(yīng)用受到較大限制。目前，Che制劑新技術(shù)研究有固體分散體[5]、脂質(zhì)體[6]、固體脂質(zhì)納米粒[8]等報(bào)道。

將難溶性藥物制備成納米粒，可提高生物利用度及藥效等，因而在藥物制劑新技術(shù)研究中占據(jù)重要的地位。與脂質(zhì)納米粒相比，聚合物納米粒具有更高的包封率及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且可通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾賦予納米粒更多功能，因而具有更高的生物利用度及藥效[9]，頗受醫(yī)藥研究者的重視。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物［methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid)，mPEG-PLGA］是一種兩親性嵌段共聚物，具有良好的生物相容性，作為一種優(yōu)良的藥物載體被廣泛用于醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域。已有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道將其應(yīng)用于制備mPEG-PLGA納米粒[10-11]，可供口服或注射給藥，有效解決了難溶性藥物溶解度和溶出度低的問(wèn)題，提高生物利用度及療效等。本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)白屈菜紅堿-甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸納米粒（chelerythrine mPEG-PLGA nanoparticles，Che@mPEG-PLGA/NPs）進(jìn)行處方研究[12]，比較體外釋藥行為和口服藥動(dòng)學(xué)行為，期望為Che納米制劑研究提供新策略。

1 儀器與材料

1260型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；BSA224S型電子天平，賽多利斯儀器公司；KH-501型超聲儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；08-2G型恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；RC-6D型溶出儀，天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司；超濾離心管，截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000，美國(guó)Millipore公司；Talos F200S G2型透射電子顯微鏡（TEM），賽默飛儀器公司；Empyrean型X射線衍射儀，馬爾文帕納科公司；透析袋，截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～10 000，美國(guó)Viskae公司；Master-sizer型粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器公司；FD-1D-80型真空凍干機(jī)，江蘇天翔儀器有限公司。

Che對(duì)照品，批號(hào)110807-201009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；Che原料藥，批號(hào)191125，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，南京邦諾生物科技有限公司；鹽酸小檗堿對(duì)照品，批號(hào)20201028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%，成都德思特生物技術(shù)有限公司；mPEG-PLGA，相對(duì)分子質(zhì)量2000～18 000，廣州市碳水科技有限公司；海藻糖，批號(hào)190210，南京松冠生物科技有限公司；泊洛沙姆188，批號(hào)WPEE587E，德國(guó)巴斯夫有限公司；甘露醇，批號(hào)20191105，上?？道噬锟萍加邢薰荆痪凵嚼骢?80，批號(hào)20191105，湖南爾康制藥有限公司；其他試劑均為分析純。

SD大鼠，雌雄兼用，購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-007，購(gòu)時(shí)周齡為6周，體質(zhì)量為（200±20）g，實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)飼養(yǎng)1周至體質(zhì)量為（240±20）g，藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循威海海洋職業(yè)學(xué)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Che@mPEG-PLGA/NPs的制備[11]

取60 mg的Che和處方量的mPEG-PLGA溶于15 mL丙酮，超聲溶解，得有機(jī)相。配制一定濃度含有乳化劑的水溶液作為水相，在磁力攪拌速率為850 r/min條件下將有機(jī)相逐滴滴加至水相中，滴畢后繼續(xù)磁力攪拌15 min。將混懸液置于45 ℃水浴中減壓旋蒸25 min，以除盡有機(jī)溶劑，在一定功率下超聲一定時(shí)間，過(guò)0.45 μm水相微孔濾膜，補(bǔ)加蒸餾水至初始水相體積，即得Che@mPEG-PLGA/ NPs混懸液。空白mPEG-PLGA/NPs同法制備（不加Che）。

2.2 Che@mPEG-PLGA/NPs含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為1%三乙胺水溶液（稀磷酸調(diào)pH至3.2）-甲醇（70∶30）；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。理論塔板數(shù)以Che峰計(jì)不低于6500。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取Che對(duì)照品10 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，即得400 μg/mL Che對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液的配制 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液1 mL至100 mL量瓶中，加入丙酮30 mL超聲6 min，放置30 min，甲醇稀釋至刻度線。精密量取2 mL置于10 mL量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度線，取適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 空白對(duì)照溶液 取空白mPEG-PLGA/NPs，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得空白對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性考察 分別取空白對(duì)照溶液、Che對(duì)照品溶液和Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍o料不干擾Che含量測(cè)定，專屬性高。

圖1 空白對(duì)照溶液(A)、Che對(duì)照品溶液(B)和Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液(C)的HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液，采用流動(dòng)相分別配制成質(zhì)量濃度為10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄Che的峰面積。以Che質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），Che各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝21.049 6－0.715 8，＝0.999 6，結(jié)果表明Che線性范圍為0.05～10 μg/mL。

2.2.7 精密度考察 取質(zhì)量濃度分別為10、1、0.05 μg/mL的Che對(duì)照品溶液，各質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得Che峰面積RSD值分別為0.31%、0.26%、0.58%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察 取Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液，于制備后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得Che峰面積的RSD為1.04%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性考察 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得Che質(zhì)量濃度的RSD為1.71%，表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率考察 取9份0.5 mL的Che@ mPEG-PLGA/NPs混懸液，分為低、中、高3組，每組均3份，分別加入400 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3 mL。按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算Che質(zhì)量濃度及其加樣回收率。結(jié)果顯示，Che平均加樣回收率為99.26%，RSD為1.70%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)加樣回收率較高。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及ζ電位的測(cè)定

2.3.1 游離藥物回收率的測(cè)定[13]采用1.2%泊洛沙姆188配制Che質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，作為游離藥物溶液。取9份0.5 mL的Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液，分為低、中、高3組，每組3份，分別加入游離藥物溶液0.25、0.50、0.75 mL，于低溫（4 ℃）條件下10 000 r/min離心（離心半徑4 cm）30 min，取外管超濾液進(jìn)HPLC測(cè)定游離Che質(zhì)量濃度，計(jì)算Che的回收率。結(jié)果顯示低、中、高3組的平均加樣回收率為101.73%，RSD為1.48%，因此方法回收率良好。

2.3.2 包封率和載藥量的測(cè)定 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液1 mL至超濾管中，于低溫（4 ℃）條件下10 000 r/min離心（離心半徑4 cm）30 min，取外管中的續(xù)濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定游離Che質(zhì)量濃度，計(jì)算含量（游離）。按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)HPLC測(cè)定Che總質(zhì)量濃度，并計(jì)算總量（總）。精密量取5 mL納米?；鞈乙褐糜诟稍锖愣ㄙ|(zhì)量的稱量瓶中，預(yù)凍后冷凍干燥，稱定質(zhì)量（0），計(jì)算包封率和載藥量。

包封率＝(總－游離)/總

載藥量＝(總－游離)/0

2.3.3 粒徑及ζ電位的測(cè)定 取Che@mPEG-PLGA/ NPs混懸液0.1 mL置于離心管中，加入4 mL蒸餾水搖勻。取適量，于粒度分析儀上測(cè)定粒徑、多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）及ζ電位。

2.4 Che@mPEG-PLGA/NPs處方單因素考察

2.4.1 mPEG-PLGA型號(hào)的選擇 Che為60 mg，mPEG-PLGA用量為500 mg，泊洛沙姆188用量為0.8%，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，超聲功率為300 W，超聲時(shí)間為10 min的條件下，分別考察不同mPEG-PLGA型號(hào)對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。包封率和載藥量均隨著PLGA相對(duì)分子質(zhì)量的增加而增加，可能是由于PLGA相對(duì)分子質(zhì)量越大，載體的親水性降低，遇到水相形成的納米粒愈牢固、穩(wěn)定，故后續(xù)均選擇mPEG-PLGA（2000～18 000）來(lái)制備Che@mPEG-PLGA/NPs。

表1 mPEG-PLGA型號(hào)的影響(,n = 3)

2.4.2 mPEG-PLGA用量的考察 固定Che為60 mg，泊洛沙姆188用量為0.8%，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，超聲功率為300 W，超聲時(shí)間為10 min條件下，分別考察不同mPEG-PLGA用量對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。隨著mPEG-PLGA用量的增加，包封率先增加后減小，可能是由于體系中mPEG-PLGA用量增加可有效包載藥物，但用量過(guò)多時(shí)mPEG-PLGA之間可能會(huì)發(fā)生聚集，反而不利于包載藥物[10]，導(dǎo)致包封率及載藥量下降，且粒徑也有增大趨勢(shì)，因此有必要進(jìn)一步優(yōu)化其用量。

2.4.3 水相與有機(jī)相體積比的考察 Che用量為60 mg，泊洛沙姆188用量為0.8%，mPEG-PLGA用量為500 mg，超聲功率300 W，超聲時(shí)間為10 min條件下，分別考察不同水相與有機(jī)相體積比對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。水相較少時(shí)體系黏度較大，不利于mPEG-PLGA包裹藥物形成納米粒。隨著水相的增加，納米粒包封率先增加后減小，可能是由于隨著水相的增加，處方中表面活性劑的用量也隨之增加，進(jìn)而在表面活性劑的作用下使藥物進(jìn)入水相中，導(dǎo)致包封率及載藥量出現(xiàn)下降。但水相的增加有利于形成較小粒徑的Che@mPEG-PLGA/NPs。水相與有機(jī)相體積比為2∶1時(shí)納米粒各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)較好，但有必要進(jìn)一步優(yōu)化。

表2 mPEG-PLGA用量的影響(,n = 3)

表3 水相與有機(jī)相體積比的影響(,n = 3)

2.4.4 表面活性劑種類的考察 Che用量為60 mg，表面活性劑用量均為0.8%，mPEG-PLGA用量為500 mg，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，超聲功率300 W，超聲時(shí)間為10 min條件下，分別考察不同表面活性劑種類對(duì)對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。聚山梨酯-80或聚乙烯醇作為表面活性劑時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均較泊洛沙姆188差，聚乙烯醇具有一定的毒性[10]，故選擇泊洛沙姆188作為制備Che@ mPEG-PLGA/NPs的表面活性劑。

2.4.5 泊洛沙姆188用量的影響 Che用量為60 mg，mPEG-PLGA用量為500 mg，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，超聲功率300 W，超聲時(shí)間為10 min條件下，分別考察不同泊洛沙姆188用量對(duì)納米粒包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。未加泊洛沙姆188時(shí)包封率、載藥量均較低，粒徑較大。隨著泊洛沙姆188用量的增加，包封率及載藥量均增加后減小，可能是由于泊洛沙姆188用量越大，體系的黏度越大，藥物與水相反應(yīng)變慢，影響了載體對(duì)藥物的包裹，也增加了制劑中輔料用量，使載藥量下降。另外，表面活性劑的增溶作用使藥物進(jìn)入水相，最終影響了包封率及載藥量。當(dāng)泊洛沙姆188用量較低時(shí)油水之間的界面張力較大，導(dǎo)致粒徑較大，隨著用量的增加，油水界面張力下降，有利于形成粒徑較小的納米粒，但濃度過(guò)高時(shí)體系的黏度也隨之上升，反而導(dǎo)致粒徑有所變大。因此需要對(duì)泊洛沙姆188用量進(jìn)行優(yōu)化。

表4 表面活性劑種類的影響(,n = 3)

表5 表面活性劑泊洛沙姆188用量的影響(,n = 3)

2.4.6 超聲功率的影響 超聲的主要目的是為了降低mPEG-PLGA納米粒粒徑[13]，而且適當(dāng)?shù)某曈欣趍PEG-PLGA材料包載藥物，但過(guò)大的超聲功率或過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)對(duì)材料造成破壞[14]，從而影響包封率及載藥量，因此有必要進(jìn)行考察。Che用量為60 mg，mPEG-PLGA用量為500 mg，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，泊洛沙姆188用量為1.0%，超聲時(shí)間為10 min條件下，分別考察超聲功率對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W時(shí)，納米粒的包封率和載藥量均下降，超聲功率達(dá)到500 W時(shí)粒徑明顯開(kāi)始變大，可能是較高的超聲功率對(duì)納米粒有破壞作用所致。由于功率為300 W時(shí)納米粒各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)理想，故確定超聲功率為300 W。

2.4.7 超聲時(shí)間的影響 Che用量為60 mg，mPEG-PLGA用量為500 mg，水相與有機(jī)相體積比為2∶1，泊洛沙姆188用量為1%，超聲功率為300 W條件下，分別考察不同超聲時(shí)間對(duì)包封率等考察指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。合適的超聲時(shí)間有利于mPEG-PLGA包裹藥物，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而對(duì)納米粒有破壞作用，超聲增溶作用也使藥物進(jìn)入水相，最終影響包封率及載藥量等。較長(zhǎng)的超聲時(shí)間也會(huì)使納米粒重新融合、聚集，導(dǎo)致粒徑變大。綜合考慮納米粒的各項(xiàng)指標(biāo)，最終確定超聲時(shí)間為12 min。

表6 超聲功率的影響(,n = 3)

表7 超聲時(shí)間的影響(,n = 3)

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，mPEG-PLGA用量、水相與有機(jī)相體積比和泊洛沙姆188用量對(duì)Che@mPEG-PLGA/NPs各項(xiàng)指標(biāo)影響較大，分別作為自變量1、2、3。對(duì)納米制劑來(lái)講，包封率和載藥量是重要參數(shù)，故作為考察指標(biāo)；納米粒粒徑大小可能影響制劑的生物利用度[15]，因而也選為考察指標(biāo)，Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表8。為更直觀地評(píng)價(jià)，將包封率、載藥量和粒徑轉(zhuǎn)化為總評(píng)歸一值（overall desirability，OD），計(jì)算過(guò)程：①包封率（1）和載藥量（2）計(jì)算公式為1或2＝(M－min)/(max－min)；粒徑（3）計(jì)算公式為3＝(max－i)/(max－min)。②OD＝(12…d)1/k，為指標(biāo)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表8，其中各試驗(yàn)組的包封率RSD均在0.57%～1.94%，載藥量RSD在0.13%～1.84%，粒徑RSD在0.48%～1.92%。

2.5.2 模型的擬合、效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 對(duì)數(shù)據(jù)擬合后得OD的2次多元回歸方程為OD＝0.82＋0.151＋0.122＋0.133－0.1112＋0.2813＋0.1323－0.1312－0.2322－0.2732，方差分析結(jié)果見(jiàn)表9，該模型的＝0.019 0＜0.05，說(shuō)明該模型具有顯著性意義。另外，2＝0.932 9，adj2＝0.900 8，失擬項(xiàng)＝0.215 1＞0.05，證明該數(shù)學(xué)模型干擾小，可信度較高。因此，可采用此模型對(duì)Che@mPEG-PLGA/NPs的處方進(jìn)行研究。1、3、13、22和32均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05、0.01）。

三維曲面圖見(jiàn)圖2，Che@mPEG-PLGA/NPs最佳處方為mPEG-PLGA用量572.41 mg、水相與有機(jī)相的體積比為2.28∶1、泊洛沙姆188用量為1.17%。預(yù)測(cè)的包封率、載藥量和粒徑分別為83.67%、4.69%和160.94 nm。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果(n = 3)

表9 方差分析

圖2 各自變量與響應(yīng)值的三維圖

2.6 最佳處方工藝的確定及微觀形態(tài)觀察

考慮到實(shí)際可操作性，調(diào)整mPEG-PLGA用量為572 mg、水相與有機(jī)相的體積比為2.3∶1、泊洛沙姆188用量為1.2%。平行制備3批Che@mPEG-PLGA/NPs，分別測(cè)定包封率、載藥量和粒徑，計(jì)算偏差［偏差＝(預(yù)測(cè)值－實(shí)際值)/預(yù)測(cè)值］，結(jié)果見(jiàn)表10。Che@mPEG-PLGA/NPs包封率、載藥量和粒徑相對(duì)偏差均小于±5%，證明采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化Che@mPEG-PLGA/NPs處方具有預(yù)測(cè)性較好，可靠性高的特點(diǎn)。粒徑分布圖見(jiàn)圖3，粒徑分布范圍在60～400 nm，PDI為0.093±0.014；ζ電位為（?23.91±1.84）mV，見(jiàn)圖4。

表10 預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的比較(,n = 3)

取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液，蒸餾水稀釋50倍，滴加于帶支持膜的銅網(wǎng)上，鋪展后靜置6 min，滴加2%磷鎢酸染色，晾干，于TEM下觀察Che@mPEG-PLGA/NPs形態(tài)，拍照，結(jié)果見(jiàn)圖5。外貌呈球形或類球形，納米粒子之間無(wú)黏連。TEM觀察到粒徑與粒度分析儀測(cè)得的粒徑存在一定的差別，這可能由于粒度分析儀測(cè)得的是水化粒子的粒徑，而TEM觀察的是干燥粒子的粒徑[16]。

圖3 Che@mPEG-PLGA/NPs的粒徑分布

圖4 Che@mPEG-PLGA/NPs的ζ電位

圖5 Che@mPEG-PLGA/NPsTEM圖

2.7 凍干粉的制備

取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液加入6%的凍干保護(hù)劑（海藻糖-甘露醇1∶1），搖勻至溶解澄清，置于溫度為?30 ℃的超低溫冰箱中預(yù)凍2 d。迅速置于初始溫度為?30 ℃冷凍干燥機(jī)中，抽真空，進(jìn)行低溫凍干1 d，然后緩慢回復(fù)常壓，取出凍干粉，立即密封，置于干燥器中保存。所得凍干粉外觀飽滿，色澤均一。凍干前后外觀見(jiàn)圖6。

取適量?jī)龈煞壅麴s水復(fù)溶，測(cè)得包封率略下降至（82.64±1.41）%，粒徑增長(zhǎng)至（172.64±9.13）nm，ζ電位為（?22.86±1.72）mV。

圖6 Che@mPEG-PLGA/NPs(A)及凍干粉外觀(B)

2.8 體外釋藥行為研究及模型擬合

取Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉，使Che含量均為30 mg，加入空白釋藥介質(zhì)5 mL，制備混懸液并置于透析袋中，兩端扎緊。釋放介質(zhì)為900 mL的pH 6.8緩沖鹽水溶液，介質(zhì)溫度（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h取樣3 mL，并補(bǔ)加3 mL空白釋放介質(zhì)。各樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定Che質(zhì)量濃度。同法考察Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉在pH 1.2鹽酸水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液的釋藥情況，結(jié)果見(jiàn)圖7。Che@mPEG-PLGA/NPs在3種不同pH值介質(zhì)中均呈現(xiàn)兩相特征，0～4 h時(shí)間段釋藥相對(duì)較快，而在4～36 h呈現(xiàn)緩釋特征。Che@ mPEG-PLGA/NPs凍干粉在pH 1.2鹽酸水溶液、pH 6.8緩沖鹽水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液中36 h的累積釋放率分別為75.25%、70.09%、68.93%。Che@ mPEG-PLGA/NPs在pH 1.2鹽酸水溶液中的釋藥速率快于pH 6.8緩沖鹽水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液[10]。分別采用零級(jí)、一級(jí)、Higuchi和Weibull模型對(duì)Che@mPEG-PLGA/NPs在3種不同pH值介質(zhì)體外釋藥進(jìn)行擬合，并采用擬合相關(guān)系數(shù)（2）作為判斷依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種不同pH值介質(zhì)體外釋藥過(guò)程均與Weibull模型擬合度最高。其中在pH 1.2鹽酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1－M/￥)]＝0.384 2 ln－1.014 3，2＝0.975 2，在pH 6.8磷酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1－M/￥)]＝0.398 4 ln－1.206 1，2＝0.988 6，在pH 7.4磷酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1－M/￥)]＝0.429 0 ln－1.347 4，2＝0.991 2。代表時(shí)間，M為時(shí)間累積釋放度，￥為￥時(shí)間累積釋放度，M/￥為時(shí)間累積釋放率。

圖7 Che@mPEG-PLGA/NPs體外釋放曲線(,n = 6)

2.9 晶型研究

X射線粉末衍射法（X-ray powder diffraction，XRPD）對(duì)Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉作晶型分析，取Che原料藥、空白輔料、物理混合物（Che和輔料比例與Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉一致）和Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉適量進(jìn)行掃描。條件為Cu-Kα靶，掃描角度（2）為3°～45°，速度為5°/min，見(jiàn)圖8。Che原料藥在7.8°、9.6°、10.0°、14.6°、16.1°、25.8°、26.7°等處出現(xiàn)明顯的晶型峰。由于輔料的掩蔽作用，Che在物理混合物中僅可觀察到在7.8°、9.6°、16.1°、25.8°、26.7°的晶型峰，說(shuō)明Che在物理混合物中仍是晶型物質(zhì)。但Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉的XRPD圖譜中，未見(jiàn)Che原料藥的任何晶型峰，說(shuō)明Che在凍干粉轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型物質(zhì)。

2.10 凍干粉穩(wěn)定性考察 前期考察發(fā)現(xiàn)，未凍干的Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液在第10天即可觀察到沉淀，說(shuō)明未凍干時(shí)穩(wěn)定性較差，故將其制備成凍干粉來(lái)改善穩(wěn)定性。取制備的Che@mPEG- PLGA/NPs凍干粉，密封，置于恒溫恒濕箱中（溫度30 ℃，濕度55%），分別于0、10、20、30、40、60、90 d取樣，測(cè)定包封率、粒徑和ζ電位，結(jié)果見(jiàn)表11。結(jié)果顯示，Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉各個(gè)指標(biāo)波動(dòng)較小，穩(wěn)定性得到明顯改善。

圖8 Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉(A)、物理混合物(B)、空白輔料(C)和Che原料藥(D)的XRPD結(jié)果

表11 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(,n = 3)

2.11 口服藥動(dòng)學(xué)研究

2.11.1 實(shí)驗(yàn)方案 取Che、物理混合物（Che和輔料比例同Che@mPEG-PLGA/NPs）和Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉適量，加入0.5%的CMC-Na水溶液配制灌胃液，臨用現(xiàn)配。取禁食12 h的健康SD大鼠18只，拋幣法隨機(jī)分成3組，每組6只，對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱定質(zhì)量，ig劑量均為20 mg/kg，計(jì)時(shí)，于0.167、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h，Che@mPEG-PLGA/NPs取血點(diǎn)延長(zhǎng)至18 h，各點(diǎn)均取血約0.2 mL，引流至肝素化EP管中，4000 r/min離心3 min，取血漿于?20 ℃保存。

2.11.2 血漿樣品的制備[6]取解凍后的血漿樣品100 μL至5 mL的EP管中，加入20 μL鹽酸小檗堿內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為1200 ng/mL）和甲醇0.5 mL（沉淀蛋白），渦旋混勻得混懸液，繼續(xù)加入2 mL氯仿進(jìn)行提取，渦旋2 min。10 000 r/min離心5 min（溫度為?4 ℃，離心半徑4 cm），取上清液于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈珊蟮脷堅(jiān)?，加入甲?00 μL復(fù)溶，繼續(xù)10 000 r/min離心5 min（溫度為?4 ℃），即得血漿樣品溶液。

2.11.3 血漿對(duì)照品的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，甲醇配制成1200 ng/mL作為藥動(dòng)學(xué)研究用內(nèi)標(biāo)溶液。取Che對(duì)照品，用甲醇配成2500、2000、1000、500、100、50 ng/mL，各質(zhì)量濃度分別量取100 μL于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈珊蟮脷堅(jiān)?，加?00 μL空白血漿，渦旋混勻，后續(xù)按“2.11.2”項(xiàng)方法處理后進(jìn)HPLC。以Che與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（），Che質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），得血漿對(duì)照品回歸方程為＝0.033 8－0.379 2，相關(guān)系數(shù)（）＝0.996 2，線性范圍為50～2500 ng/mL。

2.11.4 方法學(xué)驗(yàn)證 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液和血漿樣品，進(jìn)樣測(cè)定，考察該色譜條件的專一性，結(jié)果見(jiàn)圖9?？梢?jiàn)，血漿內(nèi)源性物質(zhì)未對(duì)內(nèi)標(biāo)及Che色譜峰產(chǎn)生干擾，專屬性高。

圖9 空白血漿(A)、血漿對(duì)照品溶液(B)、血漿樣品(C)的HPLC圖

取Che質(zhì)量濃度為50（低）、1000（中）、2500 ng/mL（高）的血漿對(duì)照品溶液，各質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得Che和內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD分別為7.05%、4.11%、6.30%，因此日內(nèi)精密度良好。

低、中、高質(zhì)量濃度每天進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)定6 d，測(cè)定Che和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算得兩者比值的RSD分別為8.04%、4.79%、6.28%，因此日間精密度良好。

取血漿樣品分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定Che和鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算得兩者比值的RSD為9.27%，因此血漿樣品穩(wěn)定性良好。

取50（低）、1000（中）、2500 ng/mL（高）Che的對(duì)照品溶液各100 μL，共3組，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈珊蟮脷堅(jiān)?，加入空白血漿100 μL，渦旋混勻，按“2.11.2”項(xiàng)方法操作，進(jìn)樣，測(cè)定Che和內(nèi)標(biāo)峰面積，兩者比值帶入方程＝0.033 8－0.379 2計(jì)算測(cè)得Che質(zhì)量濃度，與實(shí)際質(zhì)量濃度比較得出回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為94.07%（＝9），RSD為6.91%，說(shuō)明回收率較高。

取質(zhì)量濃度為50 ng/mL血漿對(duì)照品溶液（不含內(nèi)標(biāo)）逐步稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10作為定量限，信噪比為3作為檢測(cè)限，結(jié)果顯示Che的定量限和檢測(cè)限分別為5.0、2.5 ng/mL。

2.11.5 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 采用3P97軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用非參數(shù)法秩和對(duì)達(dá)峰時(shí)間（max）及半衰期（1/2）檢驗(yàn)，峰濃度（max）和曲線下面積（AUC）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。Che、物理混合物和Che@mPEG-PLGA/NPs藥動(dòng)學(xué)曲線見(jiàn)圖10，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表12。

Che和輔料的物理混合物主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與Che原料藥相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），說(shuō)明輔料在一定程度上影響了Che的口服吸收，但影響并不顯著。Che@mPEG-PLGA/NPs的max延后至（2.12±0.46）h，1/2延長(zhǎng)至（5.66±0.93）h，max增加至4.49倍，均具有極顯著性差異（＜0.01），相對(duì)口服吸收生物利用度提高至4.66倍（與Che相比）。可見(jiàn)，處方中的輔料具有一定的促吸收作用（＞0.05），但Che@mPEG-PLGA/NPs對(duì)Che藥動(dòng)學(xué)行為影響更大，促吸收作用顯著。

3 討論

本研究采用mPEG-PLGA作為納米載體，保留了PLGA載體的相容性好、安全性高等優(yōu)勢(shì)[17-18]，經(jīng)mPEG修飾后彌補(bǔ)了PLGA疏水性強(qiáng)的缺陷。楊錦等[2]采用mPEG-PLGA（2000～15 000）制備了mPEG-PLGA納米粒，其包封率（80.18±1.11）%低于采用mPEG-PLGA（2000～18 000）制得的納米粒，且表面活性劑用量（1.8%）較大，可能存在一定的安全隱患，可見(jiàn)mPEG-PLGA型號(hào)的選擇較為重要，可能會(huì)影響處方中其他輔料的用量。mPEG-PLGA納米粒的粒徑一般較PLGA納米粒低，可能是由于mPEG修飾后增加了聚合物載體的親水性，在形成納米粒時(shí)與水相之間的表面張力下降所致[17]。但mPEG-PLGA納米粒的ζ電位絕對(duì)值往往不高，可能是由于納米粒表面的mPEG接枝具有屏蔽作用所致[11]，故本研究將其制備成凍干粉來(lái)增加Che@ mPEG-PLGA/NPs的穩(wěn)定性。

圖10 藥-時(shí)曲線(,n = 6)

表12 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(,n = 6)

與Che比較：**＜0.01；與物理混合物比較：##＜0.01

**< 0.01Che bulk drug;##< 0.01physical mixture

在一定范圍內(nèi)的mPEG-PLGA載體用量及水相與有機(jī)相體積比會(huì)影響體系黏度，進(jìn)而對(duì)包封率產(chǎn)生影響，分析原因可能是由于體系黏度較高時(shí)不利于mPEG-PLGA材料在溶劑中充分舒展[19]，從而影響載體mPEG-PLGA和Che的聚合幾率及速度。較大的水相體積導(dǎo)致包封率較低，可能是由于水相體積較大時(shí)增加了表面活性劑用量，在其增溶作用下促使Che進(jìn)入水相[13]，從而影響了包封率。但較大的水相比例制得的納米粒粒徑較小，可能是由于水相體積較大時(shí)可降低體系黏度，納米粒更易分散，減少融合或聚合幾率，從而有助于降低粒徑。結(jié)合單因素考察結(jié)果，選擇mPEG-PLGA用量?jī)?yōu)化區(qū)間為400～600 mg，水相與有機(jī)相體積比優(yōu)化區(qū)間為1∶1～3∶1。泊洛沙姆188用量也會(huì)影響Che@ mPEG-PLGA/NPs的各項(xiàng)指標(biāo)，可能是由于當(dāng)其濃度較低時(shí)乳化能力有限，影響制劑的粒徑；濃度過(guò)大時(shí)不僅影響制劑的安全性，也會(huì)因增溶作用最終對(duì)包封率及載藥量造成影響，故也選為主要因素之一，結(jié)合單因素考察結(jié)果選擇優(yōu)化區(qū)間為0.6%～1.4%。

Che@mPEG-PLGA/NPs體外釋藥過(guò)程分為2個(gè)階段，即快速釋藥期和緩慢釋藥期。納米制劑中的游離藥物與納米藥物存在交換平衡，如將游離藥物除去不僅可能會(huì)打破兩者之間的平衡，進(jìn)而影響制劑的穩(wěn)定性，也可能破壞mPEG-PLGA納米粒的結(jié)構(gòu)，故未將游離藥物除去。由于未除去的游離藥物快速釋放，另一方面分散于納米粒淺表層藥物釋放相對(duì)容易，因而產(chǎn)生了快速釋藥期。包裹于mPEG-PLGA納米粒內(nèi)部藥物釋放出去需經(jīng)歷載體材料的溶蝕后才能緩慢擴(kuò)散出去，釋藥相對(duì)困難，故出現(xiàn)了緩慢釋藥期，這種釋藥方式很可能會(huì)改變Che原料藥的藥動(dòng)學(xué)行為[9,19-20]。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，Che@mPEG-PLGA/NPs的max發(fā)生極顯著性延后，可能與Che@mPEG-PLGA/NPs本身具有緩釋特征有關(guān)[21]；其1/2延長(zhǎng)至（5.66±0.93）h，極顯著性增加了藥物的消除半衰期，增加了體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，從而利于增加生物利用度及提高藥效；max增加至4.49倍，可能是由于mPEG增加了納米粒子的親水性，減弱了黏液中黏蛋白對(duì)藥物的靜電吸引[22-23]，利于Che@mPEG-PLGA/NPs能夠透過(guò)黏液層達(dá)到上皮細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)入體循環(huán)。Che在胃腸道中容易被代謝[7]，制備成Che@mPEG-PLGA/NPs后降低了胃腸道對(duì)Che的破壞幾率，提高了藥物的穩(wěn)定性；Che@mPEG-PLGA/NPs粒徑較小，更易于通過(guò)派伊爾氏結(jié)，實(shí)現(xiàn)高效吸收[10, 24]，最終使max及相對(duì)口服吸收生物利用度得到明顯提高。本研究完成了Che@mPEG-PLGA/NPs處方工藝研究，重復(fù)性良好。凍干粉在90 d內(nèi)穩(wěn)定性較好，體外釋藥具有明顯的緩釋特征。Che以無(wú)定形狀態(tài)存在于Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉中，且口服吸收生物利用度得到顯著提高。今后繼續(xù)對(duì)Che@mPEG-PLGA/NPs的注射藥動(dòng)學(xué)、組織分布、藥效學(xué)等展開(kāi)研究[25-26]，進(jìn)一步豐富研究資料，為Che新型納米制劑研發(fā)提供借鑒。

志謝 本研究由山東省職業(yè)教育欒會(huì)妮名師工作室資助（2019）

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Formulation optimization of chelerythrine-mPEG-PLGA by Box-Behnken design-response surface method and oral pharmacokinetics study

LIU Wan-lu

Weihai Ocean Vocational College, Weihai 264300, China

Box-Behnken design-response surface method was employed to optimize the formulation of chelerythrine methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid (mPEG-PLGA) nanoparticles (Che@mPEG-PLGA/NPs), and carry outevaluation and oral pharmacokinetics study of optimal prescriptions.Nano-precipitation method was employed to prepare Che@mPEG-PLGA/NPs. Encapsulation rate, drug loading and particle size were used as evaluation indexes, single factor investigation method combined with Box-Behnken response surface design method was combined to investigate the optimal prescriptions of Che@mPEG-PLGA/NPs, and then its lyophilized powder was prepared. Stability and release behaviorof lyophilized powder was investigated. SD rats were divided into Che suspension, physical mixture and Che@mPEG-PLGA/NPs groups, blood samples were collected after gastric administration at a dose of 20 mg/kg. The plasma concentrations were determined by HPLC, main pharmacokinetic parameters and relative bioavailability were calculated.The optimal formulation of Che@ mPEG-PLGA/NPs: mPEG-PLGA dosage was 572 mg, water phase to organic phase volume ratio was 2.3∶1 and concentration of poloxamer 188 was 1.2%. Envelopment efficiency, drug loading and particle size of Che@mPEG-PLGA/NPs were (83.49 ± 1.59)%, (4.61 ± 0.14)% and (163.93 ± 8.02) nm. Drug releasehad obvious sustained-release characteristics in different pH dissolution media. Pharmacokinetic results showed thatmaxof Che@mPEG-PLGA/NPs was delayed to (2.12 ± 0.46) h,1/2was prolonged to (5.66 ± 0.93) h,maxwas increased to 4.49 times and relative oral bioavailability was enhanced to 4.66 times.Che@mPEG-PLGA/NPs can significantly improve the oral bioavailability of Che, which was worthy of further study.

chelerythrine; mPEG-PLGA; nanoparticles; Box-Behnken design-response surface method; sustained release; pharmacokinetic; oral bioavailability; nano-precipitation method

R283.6

A

0253 - 2670(2022)23 - 7361 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.006

2022-08-29

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（51804021）

劉萬(wàn)路（1981—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代給藥系統(tǒng)。Tel: (0631)7697687 E-mail: liuwanlu2010@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]