盧夢(mèng)雄 黃金科 王一帆 薛 紅 王鳳云 唐旭東,

(1 北京大學(xué)中醫(yī)藥臨床醫(yī)學(xué)院(西苑)，北京，100091； 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091)

脾是中醫(yī)臟象理論的重要組成部分，脾的生理功能主要體現(xiàn)在主運(yùn)化谷食水飲，主統(tǒng)血，在體合肉，主四肢[1]。為驗(yàn)證模型成功與否，現(xiàn)代研究者依據(jù)脾的功能和特性，用相應(yīng)的生物化學(xué)等指標(biāo)類(lèi)比。脾主運(yùn)化的功能以尿D-木糖排泄率或血清D-木糖吸收率作為輔助實(shí)驗(yàn)室參考指標(biāo)[2]，脾主統(tǒng)血?jiǎng)t類(lèi)比到凝血功能的異常，如血小板數(shù)量下降[3]，在體合肉，主四肢則被闡釋為骨骼肌生理功能的異常，表現(xiàn)在抓力、腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)水平、糖原水平下降等方面[4-6]，也有報(bào)道胃蛋白酶原和胃促生長(zhǎng)素水平的降低[7-8]。但目前對(duì)特定模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)多較單一，不全面，且對(duì)造模過(guò)程中指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化掌握頗少。

目前脾虛證造模方法多類(lèi)比脾虛證的致病因素。脾虛證的致病因素有：飲食失節(jié)，損傷脾胃；過(guò)于勞神，損傷脾氣；素稟不足或年老體衰；過(guò)服苦寒瀉下藥物，損傷脾陽(yáng)；他臟病變影響脾運(yùn)等。相應(yīng)的造模方法則有苦寒瀉下法、耗氣破氣法、飲食失節(jié)法、飲食偏嗜法、勞倦過(guò)度法等。有些造模方法采用單一因素或患者不常接觸因素，如大黃、番瀉葉等，不能真實(shí)反映現(xiàn)代人群脾虛證的成因。

東亞人群成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，出現(xiàn)腹痛、腹脹、腹瀉、腸鳴等癥狀，稱(chēng)為乳糖不耐受[9-11]，此癥狀與脾虛證類(lèi)似，而隨著近些年乳制品消費(fèi)增加，乳糖不耐受在我國(guó)發(fā)病逐漸增加[11-13]，用高乳糖飲食造模切合實(shí)際?，F(xiàn)今人群普遍工作時(shí)間長(zhǎng)，飲食不規(guī)律，在饑餓與過(guò)飽間頻繁轉(zhuǎn)換，因此勞倦過(guò)度和飲食失節(jié)是脾虛證重要的致病因素。本模型基于課題組前期工作[14-15]，用高乳糖飼料飼喂既是飲食偏嗜，又是瀉下之法，用水平臺(tái)站立法模擬勞倦過(guò)度，用不定時(shí)投喂來(lái)模擬飲食失節(jié)，是所謂復(fù)合因素法，能夠更好模擬現(xiàn)代脾虛證人群真實(shí)情況。為避免普通飼料中不可控因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使用美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)(American Institute of Nutrition，AIN)制定的AIN-93G純化飼料作為基本飼料[16]，以滿足大鼠生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)，并在保證各大營(yíng)養(yǎng)素總量不變的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)高乳糖飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠42只，7周齡，體質(zhì)量(260±20)g，購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(京)2018-0018。常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日日光燈照射(08：00-20：00)，室內(nèi)溫度(22±2)℃。本研究涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2019XLC004)。

1.1.2 試劑與儀器 40%高乳糖飼料和標(biāo)準(zhǔn)AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。配方見(jiàn)表1。D-木糖(北京酷來(lái)搏科技有限公司，貨號(hào)：CX12001-100G)，D-木糖試劑盒(Cohesionbio公司，英國(guó)，貨號(hào)：CAK1238)，大鼠胃蛋白酶原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號(hào)：34607)，大鼠饑餓素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號(hào)：30838)，三酰甘油(Triacylglycerol，TG)生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號(hào)：30371S)，腺苷三磷酸生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號(hào)：30726S)，肌糖原生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號(hào)：34667S)。水環(huán)境小平臺(tái)站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)箱體，設(shè)置15個(gè)小平臺(tái)，平臺(tái)直徑8 cm，高10 cm，平臺(tái)周邊注水，水深2 cm，水溫保持(20±2)℃(自制)。高速冷凍離心機(jī)(Siemens公司，德國(guó)，型號(hào)：Z326K)，酶標(biāo)儀(Biotek公司，美國(guó)，型號(hào)：Synergy LX)，大小鼠抓力測(cè)定儀(上海移數(shù)信息科技有限公司，型號(hào)：YLS-13A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將42只SD大鼠分為7組，其中正常組12只，模型大鼠分為造模2周組、造模3周組、造模4周組，每組6只，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組，每組4只。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)配方飲食。模型SD大鼠給予40%高乳糖飼料，并且每日17：00至次日8：00放入水平臺(tái)中，不定時(shí)給予食物。分別于2周、3周、4周處死6只造模2周組、造模3周組、造模4周組大鼠和4只正常組大鼠，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組停止造模1周，觀察后處死。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.2.1 體質(zhì)量測(cè)定 每天觀察動(dòng)物毛發(fā)神態(tài)活力，每周稱(chēng)量動(dòng)物體質(zhì)量。

1.2.2.2 糞便含水量測(cè)定 每周1次收集大鼠濕便稱(chēng)重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h，干便稱(chēng)重，含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.2.3 抓力測(cè)定 每組大鼠每周進(jìn)行1次抓力測(cè)定，連續(xù)測(cè)3次，取平均值。

1.2.2.4 血清D-木糖含量測(cè)定 取材時(shí)按1 mL/100 g劑量給大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min，離心半徑18 cm，離心15 min取血清，用分光光度法測(cè)定。

1.2.2.5 血清胃蛋白酶原酶、胃促生長(zhǎng)素、三酰甘油測(cè)定 分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法和分光光度法測(cè)定。

1.2.2.6 肌肉ATP、糖原測(cè)定 取大鼠左后腿腓腸肌液氮冷凍備用，分光光度法測(cè)定ATP、糖原含量。

1.2.2.7 小腸病理學(xué) 取大鼠幽門(mén)下15 cm腸段，用0.9%氯化鈉溶液洗凈放入多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。觀察小腸絨毛和腺體病理形態(tài)。

1.2.2.8 脾虛證判定 依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)發(fā)布的《脾虛證中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)(2017)》中脾虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]，高乳糖飼喂復(fù)合因素法大鼠模型脾虛證判定：溏稀便或水樣便，腸道脹氣，體質(zhì)量增加緩慢或減輕，納呆、少動(dòng)、皮毛干枯少光、抓力下降等。

2 結(jié)果

2.1 一般體征 正常組大鼠皮毛光亮，肛門(mén)干凈，精神良好，活動(dòng)度正常，糞便顆粒分明，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。大鼠給予高乳糖飼料1～2 d后出現(xiàn)明顯黃色水樣稀便，并且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，皮毛逐漸變黃凌亂，失去光澤，肛周出現(xiàn)污穢，倦臥瞇眼，活動(dòng)度差，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至下降。但從第3周開(kāi)始出現(xiàn)水樣便癥狀的緩解，個(gè)別出現(xiàn)成形便，體質(zhì)量也出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.2 各組體質(zhì)量比較 從造模開(kāi)始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的平均體質(zhì)量差距逐漸變大，造模3周組差距達(dá)到最大，體質(zhì)量增長(zhǎng)最緩慢。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.3 各組抓力比較 從造模開(kāi)始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組抓力差距漸大，造模3周組達(dá)到最大。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠抓力比較

2.4 各組糞便含水量比較 從造模開(kāi)始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的糞便含水量差距逐漸變大，造模2周組差距達(dá)到最大，而后回落，到造模4周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組糞便含水量比較

2.5 各組血清D-木糖水平比較 血清D-木糖水平，造模2周組較正常組明顯降低(P<0.001)，造模2周停造1周組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模3周組和造模3周停造1周組較正常組升高(P<0.01，P<0.05)，造模4周組和造模4周停造1周組較正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組血清D-木糖水平比較

2.6 各組血清胃蛋白酶原水平比較 各組較正常組血清胃蛋白酶原水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組血清胃蛋白酶原水平比較

2.7 各組血清胃促生長(zhǎng)素水平比較 造模3周停造1周組血清胃促生長(zhǎng)素水平較正常組降低(P<0.05)，造模3周組和造模3周停造1周組、造模4周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組血清胃促生長(zhǎng)素水平比較

2.8 各組血清三酰甘油水平比較 造模2周停造1周組和造模3周組血清三酰甘油水平較正常組和造模2周組增加(P<0.05)，其余組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組血清三酰甘油水平比較

2.9 各組肌肉ATP水平比較 各組與正常組之間肌肉ATP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但造模2周停造1周組、造模3周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 各組肌肉ATP水平比較

2.10 各組肌肉糖原水平比較 造模2周停造1周組糖原含量較正常組和造模2周組減少(P<0.05)。見(jiàn)圖9。

圖9 各組肌肉糖原水平比較

2.11 各組血小板計(jì)數(shù)比較 造模3周組血小板計(jì)數(shù)較正常組明顯減少(P<0.001)，其余組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖10。

圖10 各組血小板計(jì)數(shù)比較

2.12 各組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 造模2周組、造模3周組、造模4周組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組明顯增加，各停造1周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖11。

圖11 各組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.13 各組小腸病理 正常組小腸絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，密度適中，底部腺體發(fā)達(dá)。與正常組比較，造模2周組小腸絨毛凌亂，結(jié)構(gòu)破損，但依稀能看出絨毛形態(tài)。造模3周組小腸絨毛結(jié)構(gòu)完全破壞，堆疊。造模4周組小腸絨毛形態(tài)較清晰，但密度稀松。見(jiàn)圖12。

圖12 各組小腸病理比較(HE染色，×100)

3 討論

脾虛證模型從1979年北京師范大學(xué)生物系消化生理科研組用大黃水煎劑灌胃昆明種小白鼠以來(lái)[18]，產(chǎn)生出眾多的造模方法，最終都落腳在動(dòng)物表現(xiàn)出脾主運(yùn)化、脾主升舉、脾主統(tǒng)血等功能的降低，對(duì)應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的消化吸收功能不足、能量代謝低下、機(jī)體狀態(tài)衰退等臨床綜合征[19]。學(xué)界較為公認(rèn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)是D-木糖水平測(cè)試，但此指標(biāo)并不能完全覆蓋所有模型，因此有必要對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。課題組已建立高乳糖疊加水平臺(tái)法所致脾虛證模型[20]，本研究則在此基礎(chǔ)上增加饑飽失常造模因素，使之更符合真實(shí)世界的情況，并且已有模型評(píng)價(jià)指標(biāo)局限于血清D-木糖水平，只能代表脾主運(yùn)化的功能，本研究則對(duì)脾的主要功能的代表性指標(biāo)都進(jìn)行了檢測(cè)，廣泛評(píng)價(jià)本模型的適用性。脾虛是個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，不同功能明顯減弱的時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同，本研究也進(jìn)行了時(shí)間上的探索。

從一般體征來(lái)看，造模3周組脾虛證最明顯，造模4周組精神和活動(dòng)度等逐漸好轉(zhuǎn)。從體質(zhì)量來(lái)說(shuō)，造模3周組較正常組下降最多，造模4周組與正常組差異逐漸縮小。在抓力和糞便含水量方面，也是造模3周組最為明顯，造模4周組則有回升之勢(shì)。

根據(jù)分子生物學(xué)和病理學(xué)來(lái)看，則出現(xiàn)結(jié)論的分化。從血清D-木糖水平來(lái)看，造模2周組降低最為明顯，提示吸收功能的下降，造模3周組反而升高。從血清TG水平來(lái)看，造模3周組增加最為明顯，提示脾虛運(yùn)化脂質(zhì)的能力不足，導(dǎo)致其在血液中累積[21]。在血小板計(jì)數(shù)上，造模3周組明顯降低，提示3周為脾主統(tǒng)血功能下降的最優(yōu)時(shí)間節(jié)點(diǎn)。在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)上，各造模組均較正常組高，可能是由于腹瀉一直處于體液失衡狀態(tài)，也可能是因?yàn)槟芰抗?yīng)不足而代償性升高以增加供氧。小腸病理顯示，造模2周組到造模3周組結(jié)構(gòu)破壞逐漸嚴(yán)重，而造模4周組有所恢復(fù)，提示大鼠對(duì)單一濃度乳糖的耐受過(guò)程。其余指標(biāo)差異不明顯可能是由于本研究樣本量較小，也可能與相關(guān)文獻(xiàn)中造模方法與本研究不同有關(guān)。停止造模后1周，大鼠各類(lèi)指標(biāo)反彈，為后續(xù)用藥干預(yù)研究提供了參考，即造模與給藥必須同時(shí)進(jìn)行。

本模型在不同指標(biāo)上的表現(xiàn)不一致。在脾虛證的一般體征表現(xiàn)和“脾主統(tǒng)血”方面，造模3周組最為明顯，而在代表“脾主運(yùn)化”的D-木糖吸收率上則是造模2周組最為明顯。這提示脾虛證的動(dòng)態(tài)過(guò)程，即脾的不同功能的降低有先后，本模型的致病因素從影響“脾主運(yùn)化”功能進(jìn)而影響到其他功能。

綜上所述，本研究用單一高濃度乳糖飲食疊加水平臺(tái)站立與飲食失節(jié)法干預(yù)成功建立大鼠脾虛證模型，在2周時(shí)“脾主運(yùn)化”功能降低明顯，在3周時(shí)有最明顯脾虛證體征和“脾主統(tǒng)血”功能降低，生化和病理的部分證據(jù)也支持此結(jié)論。