石茗，李永沖，劉經(jīng)亮，倪明龍

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 廣東，廣州 510000)

油菜和大豆、花生、芝麻并稱(chēng)為四大油料作物，與其他各國(guó)相比，我國(guó)油菜的種植面積及其總產(chǎn)量居首位。油菜根腫病俗稱(chēng)“大根病”，又稱(chēng)“油菜根癌病”，其病原菌蕓薹根腫菌屬于專(zhuān)性的寄生菌，目前廣布全世界，在歐洲南部及地中海西岸最早出現(xiàn)，尤以溫帶地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重[1]。我國(guó)油菜于1995年初患此病[2]，現(xiàn)已遍布絕大部分地區(qū)，隨著外界環(huán)境惡化，此病的發(fā)病面積及危害程度正越來(lái)越大[3,4]。研究油菜根腫病菌的形態(tài)特征，為防治油菜根腫病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 油菜根腫病菌的形態(tài)特征

1.1.1 菌源于2019年3月在廣東省廣州市花都區(qū)油菜地采集油菜根腫病的新鮮病樣本，于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2 制備休眠孢子懸浮液參考馬淑青等[5]的方法，取油菜根腫組織，攪成勻漿，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾、沉淀等步驟制成休眠孢子懸浮液，于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.3 休眠孢子至管腔形態(tài)觀察首先，將休眠孢子懸浮液滴在銅網(wǎng)（200目）上進(jìn)行沉淀，再將多余水分吸去，接著染色（2%磷鎢酸處理），將多余染液吸干后并晾干，用透射電子顯微鏡下觀察休眠孢子形態(tài)及休眠孢子至管腔的形態(tài)演變過(guò)程并測(cè)量大小。

1.2 溫度、pH值及光照與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系

1.2.1 溫度與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設(shè)置為6.3上下，在0℃～40℃間，每隔4℃設(shè)置一個(gè)溫度，共設(shè)置11個(gè)溫度條件，分別在無(wú)光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，孢子萌發(fā)情況的觀察統(tǒng)計(jì)于5d后進(jìn)行電子顯微鏡下進(jìn)行。

1.2.2 pH值與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，在用酸度計(jì)測(cè)定pH值為2.5、3.5、4.5、5.0、6.4、7.4、8.4和9.4等8個(gè)條件下，在24℃及無(wú)光照條件下，分別進(jìn)行培養(yǎng)，在5d后，進(jìn)行電子顯微鏡下的孢子萌發(fā)情況的觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 光照與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設(shè)置為6.3上下，24℃條件下，將三角瓶置于光照度為900Lx的日光燈下照射24h及無(wú)光照培養(yǎng)24h，5d后進(jìn)行電子顯微鏡下的孢子萌發(fā)情況的觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3 致死溫度測(cè)定

在滅菌的三角瓶加入的油菜根分泌物溶液10mL及1mL孢子懸浮液，pH值設(shè)置為6.3上下，將三角瓶分別置于36℃、39℃、42℃、45℃、48℃、51℃、54℃和57℃等8個(gè)溫度設(shè)置中，恒溫水浴鍋中處理10 min，分別在24℃條件下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，休眠孢子的萌發(fā)情況5d后在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，在以上溫度中，孢子無(wú)法萌出的最低溫度，可定為致死溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜根腫病菌的形態(tài)特征

經(jīng)負(fù)染色處理后，在透射電鏡放大800倍下，可觀察到游動(dòng)孢子近腎形或近球形，大小為2.1～5.1pm，平均為3.6pm，其上著生2根長(zhǎng)短不等的尾鞭。電鏡下觀察到休眠孢子至管腔形態(tài)演化進(jìn)程為：在休眠孢子的孢子壁處，一個(gè)游動(dòng)孢子被釋放出，約20～40min后，隨著游動(dòng)孢子運(yùn)動(dòng)變得緩慢，其鞭毛逐漸脫落，而形成休止孢，同時(shí)可觀察到休止孢呈圓形，大小為1.5～2.1pm，囊化的游動(dòng)孢子發(fā)育出一個(gè)長(zhǎng)管狀空腔（管腔），此長(zhǎng)管狀空腔有2.8～3.3pm（平均3.11pm）長(zhǎng)，寬為1.2～1.3 pm（平均1.24pm）。

2.2 溫度、pH值和光照與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系

2.2.1 溫度與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系經(jīng)試驗(yàn)觀察，休眠孢子在4℃以上、40℃以下均可以萌發(fā)，試驗(yàn)結(jié)果表明，24℃是休眠孢子最適宜萌發(fā)的溫度，最適宜溫度下，可測(cè)得孢子萌發(fā)率為67.8%，非24℃時(shí)，休眠孢子的萌發(fā)率均低于最適溫度（圖1）。此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明休眠孢子萌發(fā)和溫度有重要關(guān)聯(lián)，田間發(fā)病狀況也證明了溫度的影響。

2.2.2 pH值與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系在pH6.4～7.4條件下，休眠孢子均可以萌發(fā)，試驗(yàn)表明，萌發(fā)的最適為pH6.4，此pH值下，萌發(fā)率為67.5%，其他pH值下，休眠孢子的萌發(fā)率均低于最適為pH（圖2）。

2.2.3 光照與休眠孢子萌發(fā)的關(guān)系經(jīng)過(guò)5d光照培養(yǎng)的休眠孢子，測(cè)得其萌發(fā)率為11.24%，對(duì)比經(jīng)過(guò)5d無(wú)光照處理的休眠孢子，其萌發(fā)率為70.13%，由此得出，光照對(duì)休眠孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。

2.3 致死溫度的測(cè)定

試驗(yàn)中測(cè)得休眠孢子在48℃處時(shí)的萌發(fā)率為2.46%，在51℃、54℃處理的樣品液中油鏡下未觀察到有孢子萌發(fā)，據(jù)此可以推測(cè)51℃為油菜根腫菌休眠孢子的致死溫度。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 油菜根腫病菌的發(fā)生1995年我國(guó)初次發(fā)現(xiàn)油菜根腫病[2]，根腫菌存在不同的生理小種。根腫病菌的生理小種分化在1931年被Honig首次證明,Williams系統(tǒng)和ECD系統(tǒng)是國(guó)際上廣受認(rèn)可的2個(gè)根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)。

油菜根腫病菌休眠孢子的大小明顯大于甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子[6]，導(dǎo)致這種狀況發(fā)生的原因后續(xù)課題將針對(duì)此疑問(wèn)進(jìn)行探究。

3.1.2 外部條件對(duì)油菜根腫病發(fā)生的影響研究表明，在土壤溫度10℃～30℃，尤其是當(dāng)土溫為19℃～25℃，根腫病適宜發(fā)生。因此，可適當(dāng)推遲播種進(jìn)而使土壤溫度降低從而有效控制根腫病發(fā)生。休眠孢子致死溫度為51℃。所以可以在播種前想辦法使使土壤升高（例如覆蓋地膜），達(dá)到致死溫度殺死休眠孢子，有效預(yù)防根腫病的發(fā)生。

在pH值為6.0～6.7時(shí)，休眠孢子萌發(fā)的幾率大。為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量而盲目施用大量化學(xué)復(fù)合肥料、大氣污染及酸雨等使得土壤酸化，因此在控制根腫病時(shí)，一方面，可通過(guò)增施堿性肥料中和酸性。另一方面，增施有機(jī)肥，達(dá)到培肥地力的效果。

在有光照的情況下，休眠孢子的萌發(fā)受到明顯抑制。可通過(guò)光敏色素來(lái)抑制休眠孢子萌發(fā)的進(jìn)程，進(jìn)而控制根腫病的發(fā)生。

3.2 結(jié)論

3.2.1 油菜根腫病菌的形態(tài)特征

油菜根腫病菌體眠孢子至管腔的演化進(jìn)程為：在休眠孢子的孢子壁處，一個(gè)游動(dòng)孢子被釋放出，約20～40min后，隨著游動(dòng)孢子運(yùn)動(dòng)變得緩慢，其鞭毛逐漸脫落，而形成休止孢，休止孢最后萌發(fā)而形成管狀結(jié)構(gòu)。

3.2.2 油菜根腫病菌體眠孢子的生物學(xué)特性油菜根腫病易發(fā)生的條件是：溫度為24℃，pH值為6.4，無(wú)光照。其病菌的致死溫度是51℃。