李苗苗 詹 群

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京 210022）

《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，中國心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，而絕經(jīng)后女性因激素水平變化患心血管疾病風(fēng)險增加，預(yù)防高血壓的發(fā)生為心血管健康管理零級預(yù)防策略[1]。因此，有效預(yù)防絕經(jīng)后女性血壓升高的發(fā)生對于降低絕經(jīng)后女性心血管疾病患病風(fēng)險也尤為重要。研究表明，雌激素能夠提高抗氧化物水平并增加抗氧化酶的活性，絕經(jīng)后的雌激素水平低下增強了體內(nèi)氧化應(yīng)激[2-6]。在氧化應(yīng)激增強狀態(tài)下，外周循環(huán)中增多的活性氧簇（ROS）可誘導(dǎo)炎性因子分泌，導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥反應(yīng)增強，造成內(nèi)皮損傷，引起血管內(nèi)皮中內(nèi)皮素、血栓素A2等收縮因子升高，血管收縮增強，從而引起血壓升高。此外中樞內(nèi)增多的ROS引起的氧化應(yīng)激通過刺激延髓頭端腹外側(cè)（the rostral ventrolateral medulla，RVLM）區(qū) 交 感神經(jīng)元，引起交感神經(jīng)興奮性傳出增加，導(dǎo)致血壓升高[7-10]。

益坤飲為江蘇省名中醫(yī)陳霞教授治療圍絕經(jīng)期綜合征的經(jīng)驗方，前期研究顯示益坤飲能夠調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸，提升圍絕經(jīng)期女性血清雌二醇（E2）水平，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，有效改善圍絕經(jīng)期低雌激素水平問題[11]。圍絕經(jīng)期氧化應(yīng)激與低雌激素相關(guān)，因此本研究制作卵巢去勢（ovariectomized，OVX）大鼠，以RVLM區(qū)氧化應(yīng)激情況為切入點，觀察益坤飲抗氧化作用以及對OVX大鼠血壓的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物35只健康SPF級雌性SD大鼠購自南京青龍山實驗動物中心，體重180～200g。大鼠飼養(yǎng)于恒溫（21～23 ℃）、恒濕（45%～65 %）的飼養(yǎng)室，保持12 h明暗循環(huán)，自由進食飲水。本實驗遵循美國國立衛(wèi)生研究院動物護理和使用指南，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核通過（202206A045）。

1.2 藥物與主要試劑益坤飲由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院藥劑科制劑室制備。藥物組成：熟地黃10g、枸杞子10g、白芍10g、生牡蠣15g、鉤藤15g、合歡皮10g、黃芪10g、茯苓10g、淫羊藿10g。藥物制備為生藥濃度1.7g/mL的濃縮液，臨用前用蒸餾水配成0.34g/mL、0.68g/mL兩種濃度的藥液（按生藥量計）。

替勃龍片（荷蘭歐加農(nóng)公司生產(chǎn)，南京歐加農(nóng)制藥有限公司分包裝，原藥批號615557001，分裝批號：LE-0991-10），規(guī)格：2.5 mg/片，臨用前用研缽研碎后用蒸餾水配成0.25 mg/mL的溶液（按制劑量計算）。

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（索寶來，批號：BC0175），丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（索寶來，批號：BC0025），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）活性檢測試劑盒（Abcam，批號：ab51254/UOTR1B493），去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（茁彩，批號：ZC-37121）。RIPA強裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B、P0010）；膜再生液（Solarbio，批號：SW3022）。

1.3 主要儀器智能無創(chuàng)鼠尾動脈血壓測量儀（日本軟隆有限公司，型號：BP-98A）；全波長酶標儀、低溫離心機（Thermo，型號：Multiskan Sky、Fresco17/17R）；電泳及轉(zhuǎn)模系統(tǒng)（Bio-Rad，型號：1658033）；高通量組織勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：Scientz-48）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號4600）。

2 實驗方法

2.1 造模雌性SD大鼠在無菌條件下麻醉后于下腹正中作一長約1.5 cm的豎切口，逐層切開皮膚、筋膜、腹膜，見子宮呈“Y”字形，周圍有脂肪組織包繞；用眼科顯微鑷提起子宮底，沿輸卵管找到雙側(cè)卵巢；止血鉗鉗夾卵巢根部，結(jié)扎后完整切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后予肌注青霉素20 000 U/kg，連續(xù)3 d。術(shù)后第5天開始陰道涂片，連續(xù)7 d，陰道涂片顯示性周期紊亂即提示OVX造模成功。

2.2 分組與給藥取7只雌性SD大鼠作為假手術(shù)組，手術(shù)方法、術(shù)后處理同2.1部分，但進入腹腔后不切除卵巢。造模成功的OVX大鼠隨機分為模型組、陽性藥物組和益坤飲高、低劑量組，每組7只。陽性藥物組每日按0.25 mg/kg灌胃給予替勃龍溶液，益坤飲低、高劑量組每日分別按3.4g/kg、6.8g/kg灌胃給予益坤飲濃縮液（其中高劑量相當(dāng)于人體給藥劑量），假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，各組均連續(xù)灌胃30 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 血壓測定末次給藥12 h后，各組大鼠使用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，通過股動脈監(jiān)測血壓，血壓穩(wěn)定30 min后開始記錄收縮壓、舒張壓。

2.3.2 ELISA法檢測尿去甲腎上腺素（NE）含量各組大鼠完成血壓測定后當(dāng)天開始，采用代謝籠法收集大鼠24 h尿量，加入冰醋酸作為防腐劑，并置于-20 ℃低溫冰箱保存待測。采用ELISA法檢測各組大鼠尿NE含量。

2.3.3 RVLM組 織ROS、SOD、MDA水 平 檢 測尿液收集完成后，放血處死大鼠，迅速在冰面上將各組大鼠腦組織中延髓取出，按照第3版Paxinos＆Charles Watson大鼠腦圖譜，確定RVLM的基本位置。分離RVLM核團區(qū)，轉(zhuǎn)移到Eppendorf離心管中，置于-80 ℃冰箱避光保存待測。取出組織標本，投入液氮中，置于-80 ℃冰箱中制成冰凍切片，組化筆畫圈，圈內(nèi)滴入ROS染液，避光孵育30 min，DAPI復(fù)染細胞核，避光孵育10 min，封片，于熒光顯微鏡下觀察圖像，記錄熒光讀數(shù)。ELISA法檢測各組大鼠RVLM組織SOD、MDA含量。

2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot法）檢測RVLM組織NOX4蛋白表達各組隨機取3只大鼠的RVLM組織各50 mg，研磨分裝于離心管中，加入250 μL的RIPA裂解液勻漿（使用前5 min加入蛋白酶抑制劑），4 ℃過夜裂解，提取蛋白。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入蛋白樣品及裂解液，輕輕混合后95 ℃變性10 min。制備SDS-PAGE凝膠，依次進行蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，封閉后的膜放入一抗兔抗人NOX4（封閉液1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，將反應(yīng)膜放入平皿中洗膜，放入二抗羊抗兔（封閉液1∶5000稀釋），室溫下孵育1 h。用ECL顯色后，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達，用Image J軟件對各抗體條帶的灰度值進行統(tǒng)計，計算蛋白的相對表達量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 7對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。本研究所有計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示。2組間數(shù)值比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠血壓比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠收縮壓均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；益坤飲高、低劑量組大鼠收縮壓均顯著高于陽性藥物組（P＜0.05，P＜0.01），益坤飲高劑量組大鼠收縮壓明顯低于低劑量組（P＜0.01）。在舒張壓方面，各給藥組大鼠與模型組比較，各給藥組之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠血壓比較（±s） 單位：mmHg

表1 各組大鼠血壓比較（±s） 單位：mmHg

注： 與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。1 mmHg≈0.133 kPa。

3.2 各組大鼠RVLM組織ROS、SOD、MDA水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠RVLM組織ROS、MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠RVLM組織ROS水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性藥物組、益坤飲高劑量組大鼠RVLM組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD含量顯著升高（P＜0.01）。陽性藥物、高劑量益坤飲對上述指標的改善顯著優(yōu)于低劑量益坤飲（P＜0.01），陽性藥物組與益坤飲高劑量組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠RVLM組織ROS、MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組大鼠RVLM組織ROS、MDA、SOD水平比較（±s）

注： 與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

3.3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較見圖1、表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；益坤飲高劑量組、陽性藥物組大鼠RVLM組織NOX4水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且均顯著低于益坤飲低劑量組（P＜0.01）。

圖1 Western Blot法檢測各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達

表3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較（±s）

注： 與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

3.4 各組大鼠尿NE含量比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿NE含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、益坤飲高劑量組大鼠尿NE含量顯著降低（P＜0.01）。益坤飲各劑量組大鼠尿NE含量顯著高于陽性藥物組（P＜0.01），其中高劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.01）。詳見表4。

表4 各組大鼠尿NE含量比較（±s）

表4 各組大鼠尿NE含量比較（±s）

注： 與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

4 討論

《素問·至真要大論》記載：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝?！庇纱丝烧J為，血壓的波動主要責(zé)之于肝。腎藏精，肝藏血，精聚為髓，精髓化生為血（精血同源），肝腎同源于精血。女性一生經(jīng)孕產(chǎn)乳耗傷精血，故女子發(fā)病多由“真陰不足”所致。女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，腎精虧虛，故而圍絕經(jīng)期肝腎陰分不足。陰分不足，肝陽上亢，故絕經(jīng)后女性易發(fā)生血壓升高的情況。益坤飲由《景岳全書》中“歸腎丸”化裁而來，方中君藥熟地黃、枸杞子、白芍滋陰補腎、養(yǎng)血柔肝；鉤藤清降心肝郁火，生牡蠣平肝潛陽、重鎮(zhèn)安神，合歡皮行氣解郁除煩，共為臣藥；淫羊藿補腎陽，于陽中求陰，為佐藥；黃芪、茯苓健脾益氣，后天氣血以養(yǎng)先天，又以茯苓化痰利濕助運，可防止補益藥滋膩礙胃，均為使藥。全方共奏滋腎養(yǎng)陰、平肝寧心之功。

NADPH氧化酶，即還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活性氧的主要來源，其中NOX4是大腦中含量最豐富的NOX同系物，是催化生成ROS的關(guān)鍵酶[12-14]。NOX4表達上調(diào)會產(chǎn)生大量的ROS，ROS與其他物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)時會產(chǎn)生MDA。MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映了體內(nèi)氧化應(yīng)激的情況，MDA含量升高說明氧化應(yīng)激增強。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可分解清除機體有害氧自由基，起到抗氧化的作用[15]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠RVLM組織NOX4、ROS、MDA水平較假手術(shù)組顯著升高，SOD含量顯著下降，說明OVX大鼠RVLM組織氧化劑抗氧化平衡被打破，存在氧化應(yīng)激增強。

RVLM區(qū)包含了幾乎所有的運動前交感神經(jīng)血管收縮神經(jīng)元，控制脊髓外側(cè)角的交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元。同時，本研究觀察到模型組大鼠尿NE含量、收縮壓較假手術(shù)組顯著升高。因此我們認為，RVLM區(qū)氧化應(yīng)激增強而致交感中樞神經(jīng)元活性增強，導(dǎo)致交感信號流出[14]，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進引起血壓升高。

研究顯示雌激素可通過降低RVLM區(qū)氧化應(yīng)激抑制交感亢進從而改善大鼠絕經(jīng)后的心血管功能[6]。孫嫘等[16]研究發(fā)現(xiàn)針刺人迎穴可提高自發(fā)性高血壓大鼠RVLM區(qū)抗氧化能力，降低交感神經(jīng)活性從而有效緩解高血壓癥狀。本研究結(jié)果表明，益坤飲各劑量組大鼠RVLM組織ROS及NOX4水平較模型組下降，收縮壓較模型組下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明益坤飲可通過降低NADPH氧化酶降低RVLM組織活性氧水平從而影響收縮壓。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，高劑量益坤飲及陽性藥物替勃龍均能顯著上調(diào)RVLM組織SOD水平，降低RVLM組織ROS、MDA水平以及尿NE含量，因此我們推測高劑量益坤飲及替勃龍能夠有效提高中樞抗氧化能力，降低中樞氧化應(yīng)激，減弱交感神經(jīng)元活性，降低交感神經(jīng)亢進，從而控制OVX大鼠收縮壓的升高。因激素替代存在一定的副作用及遠期風(fēng)險，2018年中國絕經(jīng)管理與絕經(jīng)激素治療指南指出不推薦僅為預(yù)防心血管疾病而采用激素替代[17]，因此中醫(yī)藥用于預(yù)防絕經(jīng)后心血管疾病有較高的研究價值。

本研究中針對交感亢進的情況評估僅進行了尿液NE測定，后期研究可進行RVLM區(qū)交感神經(jīng)活動記錄，進一步明確益坤飲對RVLM交感輸出的影響，為益坤飲預(yù)防心血管疾病的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。