孫啟航，談旭華，羅莉霞

0引言

Hippo通路是一個進化上保守的信號通路，它最初在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)[1]，調(diào)控許多生物過程，包括調(diào)節(jié)細胞生長和分化，控制器官大小和再生。哺乳動物Hippo通路的核心組分包括一個激酶級聯(lián)——MST1/2、SAV1、MOB1和LATS1/2，以及下游效應(yīng)因子——轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ[2]。這些Hippo通路的核心組分通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與細胞增殖、分化、遷移和維持干細胞活性等生理活動[3-5]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路可能與很多眼部組織的發(fā)育再生和眼科疾病存在密切聯(lián)系，本文從Hippo通路的核心組分、生物學(xué)作用及其在眼科領(lǐng)域的研究進展進行了綜述。

1 Hippo通路的核心組分和調(diào)控機制

在果蠅體內(nèi)，Hippo通路核心組分包括由蛋白激酶Wart(Wts)、Salvador(Sav)、Hippo(Hpo)和Mob(Mats)[2]形成的激酶級聯(lián)，以及下游效應(yīng)因子Yorkie(Yki)。Hpo在果蠅中發(fā)生突變可導(dǎo)致器官過度生長，形成類似河馬(Hippopotamus)的外觀，故稱為Hippo通路。

從果蠅到哺乳動物，Hippo通路是高度保守的。Wts、Sav、Hpo和Mats在哺乳動物中的同源蛋白分別為LATS1/2、SAV1、MST1/2和MOB1。MST1/2與SAV1形成異二聚體，使SAV1、MOB1和LATS1/2激酶磷酸化[6-8]。LATS1/2直接磷酸化Yki同源蛋白YAP(yes-associated protein)和TAZ(transcriptional activator with PDZ-binding domain)，從而抑制其進入細胞核[9-10]。YAP/TAZ是不含DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要與TEAD(TEA/ATTS domain)家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[11-12]。Hippo通路的活性受到多種信號如機械應(yīng)力、細胞間接觸、細胞極性、代謝狀態(tài)和生長因子的嚴格調(diào)控，進而控制著YAP/TAZ在細胞核和細胞質(zhì)之間的定位變化。Hippo通路關(guān)閉時(圖1A)，未磷酸化的YAP/TAZ進入細胞核中，與TEADs和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動對細胞增殖、分化和遷移至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄程序。Hippo通路開啟時(圖1B)，活化的LATS激酶磷酸化YAP/TAZ，導(dǎo)致其與蛋白14-3-3結(jié)合并停留細胞質(zhì)中，最終被降解[13-14]。在核內(nèi)沒有YAP/TAZ的情況下，TEAD通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子VGLL4結(jié)合[15-16]，抑制靶基因如結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Cyr61[17]的表達，從而限制組織生長和細胞增殖。

2 Hippo通路的生物學(xué)作用

2.1控制器官大小控制器官大小是Hippo通路最常見的生理功能。在果蠅體內(nèi)，Hippo通路激酶或上游調(diào)節(jié)因子的突變導(dǎo)致眼、翅膀等器官的過度生長[18]。在小鼠體內(nèi)，特異性激活Yap1或敲除Mst1/2、Sav1可導(dǎo)致心臟可逆性增大[19]，并且心肌細胞的增殖和凋亡對YAP的調(diào)控敏感[20-21]。Hippo通路還可通過響應(yīng)拉伸和壓縮等機械信號來控制器官大小。在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，當細胞被拉伸時，YAP和TAZ活性升高，當細胞被壓縮時活性降低[22]。

2.2調(diào)控胚胎期細胞分化和器官發(fā)育Hippo通路在胚胎細胞分化過程中的部分作用已得到證實。敲除Tead4的小鼠胚胎不能分化出滋養(yǎng)外胚層細胞。敲除Lats1/2、Nf2等基因后，所有細胞無法分化成內(nèi)細胞團來源的組織[23-24]。此外，組織特異性的YAP缺失會導(dǎo)致小鼠心臟、骨骼和腎臟的發(fā)育異常[21,25-26]。人體內(nèi)YAP轉(zhuǎn)錄活性缺失也會導(dǎo)致眼部組織的發(fā)育異常，例如，TEAD1突變可導(dǎo)致Sveinsson脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮和Aicardi綜合征[27-28]，在視神經(jīng)裂閉合缺陷中也發(fā)現(xiàn)了YAP缺失突變[29]。由此可見，Hippo通路在早期胚胎細胞分化和器官正常發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

2.3維持干細胞活性和調(diào)控組織再生Hippo通路的效應(yīng)分子YAP/TAZ可調(diào)控不同干細胞的功能，YAP能促進胚胎干細胞的多能性[30]，TAZ可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的分化[31-32]。小鼠干細胞的基因表達譜顯示，YAP和TEAD在多種組織的干細胞中富集[33]，如腸、肝、皮膚和神經(jīng)的干細胞或祖細胞中均觀察到Y(jié)ap/Taz的高表達[34-35]。Yap/Taz條件性敲除小鼠的腸道再生能力受阻[36]。肝部分切除術(shù)后數(shù)天內(nèi)，YAP活性被誘導(dǎo)，可能是肝臟完全再生所必需的[37-38]。成人心肌的再生非常有限，然而，YAP特異性激活可使心肌的再生能力得到一定程度的恢復(fù)[39-40]。相反，心臟特異性的YAP缺失會抑制心肌的再生[41]。

2.4在細胞間黏附和接觸抑制中的作用接觸抑制是貼壁細胞與相鄰細胞進行物理接觸時停止增殖的現(xiàn)象。細胞之間的相互接觸可通過YAP和TAZ來調(diào)控細胞的增殖和存活[42]。一種可能的機制是：當細胞接觸時，黏附連接蛋白如Crumbs、PATJ、PALS和E-鈣黏蛋白可以與YAP和TAZ結(jié)合[43]，將YAP/TAZ隔離在細胞連接處，阻止它們進入細胞核，還可通過阻止YAP/TAZ去磷酸化[43]，從而抑制細胞增殖。

3 Hippo通路在眼部組織的研究進展

3.1Hippo通路在晶狀體中的研究

3.1.1維持晶狀體上皮細胞極性晶狀體的透明性依賴于晶狀體上皮細胞的有序排列，即頂端朝向晶狀體纖維，基底部朝向前囊膜，稱為晶狀體上皮細胞的頂端-基底極性。Song等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠晶狀體中，YAP蛋白與極性復(fù)合體蛋白Crb在晶狀體上皮細胞(lens epithelial cell, LEC)的頂端連接處共定位，在小鼠晶狀體中特異性敲除Yap可導(dǎo)致LEC形態(tài)由正常的立方型變扁平，并且Par和Crb極性復(fù)合體的頂端定位被破壞，上皮細胞極性紊亂，從而導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)白內(nèi)障。因此，YAP可能通過與極性復(fù)合體Par和Crb相互作用，調(diào)控它們的定位[22,45]，從而維持正常LEC的極性。

3.1.2調(diào)節(jié)晶狀體細胞增殖和纖維分化正常生理狀態(tài)下，LEC終身保持增殖和分化。LEC在持續(xù)增殖的同時，逐漸遷移至赤道部的過渡區(qū)并退出細胞周期，分化為晶狀體纖維(lens fibers, LF)細胞。Kumar等[46]發(fā)現(xiàn)，晶狀體受到的外力牽拉可作為調(diào)節(jié)Hippo通路的機械信號，改變YAP在LEC中的定位從而調(diào)節(jié)LEC增殖。YAP的上游負調(diào)節(jié)因子NF2很可能直接調(diào)節(jié)赤道部的LEC退出細胞周期[47]，并激活分化為LF細胞的基因如β-晶狀體蛋白。但是NF2是直接作用于YAP還是通過經(jīng)典的Hippo上游激酶(如MST1/2和LATS1/2)作用仍然未知。Dawes等[48]發(fā)現(xiàn)，在低濃度成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors, FGF)的刺激下，F(xiàn)GF與受體結(jié)合激活MEK-ERK1/2，促進YAP進入細胞核，與TEAD結(jié)合促進LEC增殖的基因轉(zhuǎn)錄；而在高濃度FGF刺激下，Hippo信號通路被激活，YAP被MST1/2-LATS1激酶級聯(lián)磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合，并留在細胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致LEC退出細胞周期，開始纖維分化。

3.1.3Hippo通路與白內(nèi)障白內(nèi)障即晶狀體混濁，是全球第一位的致盲眼病[49]，其確切的發(fā)病機制尚不清楚，近年研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路可能參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。He等[50]觀察到Y(jié)ap敲除小鼠在出生后1.5mo出現(xiàn)核性白內(nèi)障，表現(xiàn)為LEC數(shù)量減少、纖維細胞脫核異常和Morgagian小球積聚，且晶狀體比野生型小。YAP缺失引起白內(nèi)障的病理過程分為兩個方面——主要影響和次要影響。主要影響是YAP缺失會下調(diào)與晶狀體增殖和發(fā)育相關(guān)基因如Sox2、Pax6和Dnase2b[51-52]的表達，導(dǎo)致LEC增殖減少。次要影響是YAP缺失加速晶狀體細胞衰老并導(dǎo)致晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白水平降低以及炎癥因子水平增加，最終促進白內(nèi)障的形成。此外，Lu等[53]的研究發(fā)現(xiàn)小鼠中Yap1的雜合缺失可導(dǎo)致成年期白內(nèi)障，大多數(shù)Yap1雜合小鼠在出生后6mo時出現(xiàn)了白內(nèi)障，且晶狀體存在多種形態(tài)缺陷，包括囊膜破裂、皮質(zhì)內(nèi)空泡和纖維斷裂?？赡艿臋C制是：Yap1基因的雜合缺失導(dǎo)致其靶基因Crim1無法維持足夠的表達，使LEC不能持續(xù)增殖，從而造成晶狀體發(fā)育異常和混濁[54]。總而言之，Hippo通路在晶狀體上皮的增殖、分化中具有不可或缺的作用，Hippo通路核心成分有望作為研究晶狀體發(fā)育的重要分子，并且可能有助于某些先天性白內(nèi)障的診斷和預(yù)測。

3.2Hippo通路在視網(wǎng)膜中的研究

3.2.1調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜發(fā)育在視泡發(fā)育過程中，神經(jīng)視網(wǎng)膜(neural retina, NR)和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)來自共同的祖細胞[55-56]。在斑馬魚中[57]，YAP/TAZ-TEAD信號在視杯發(fā)生過程中處于活躍狀態(tài)，而yap-/-突變體表現(xiàn)出RPE缺陷，說明YAP和TAZ可調(diào)節(jié)RPE細胞命運，潛在機制是YAP/TAZ通過與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，從而調(diào)節(jié)RPE細胞分化。在非洲爪蟾胚胎中，YAP和參與許多發(fā)育過程的蛋白PKNOX1[58]相互作用，控制視網(wǎng)膜干細胞中S期的進程并維持基因組穩(wěn)定。Kim等[59]的研究發(fā)現(xiàn)，YAP可能通過促進視網(wǎng)膜祖細胞從G1期過渡到S期，以及加快S期和G2期的進程，從而維持視網(wǎng)膜祖細胞的增殖活性。

圖1 Hippo通路的核心組分 A：當Hippo通路關(guān)閉時，YAP/TAZ去磷酸化并進入細胞核，在核內(nèi)與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄；B：當Hippo通路開啟時，活化的LATS激酶使YAP/TAZ磷酸化，與14-3-3結(jié)合，停留在胞質(zhì)中并被降解，此時TEAD與VGLL4結(jié)合，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。

3.2.2調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜Müller細胞重編程和纖維分化視網(wǎng)膜Müller細胞在視網(wǎng)膜損傷時能夠重新進入細胞周期并產(chǎn)生多能祖細胞，參與視網(wǎng)膜再生[60]，還可以轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞促進視網(wǎng)膜纖維化[61]。Rueda等[62]的研究發(fā)現(xiàn)，YAP可促進Müller細胞表達cyclin D1，重編程為視網(wǎng)膜祖細胞，而Hippo通路激活可通過抑制YAP的活性阻止視網(wǎng)膜再生。在糖尿病小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)[63]，高血糖條件下視網(wǎng)膜Müller細胞中的YAP被激活，從而使Müller細胞發(fā)生纖維分化和收縮，并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和釋放促纖維化因子，增加的ECM又反過來激活YAP，形成促進視網(wǎng)膜纖維化的循環(huán)，最終導(dǎo)致糖尿病牽拉性視網(wǎng)膜脫離。因此，Hippo通路有助于視網(wǎng)膜再生療法的研究，如何調(diào)控Hippo通路來促進視網(wǎng)膜再生并減少視網(wǎng)膜纖維化是一個值得探討的問題。

3.2.3參與視網(wǎng)膜微血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子激活因子3(STAT3)是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡[64]并促進缺血視網(wǎng)膜中的新生血管形成[65]。YAP與STAT3相互作用以促進STAT3的磷酸化激活、核易位和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管形成[66]。此外，STAT3通過降低緊密連接蛋白ZO-1和Occludin[67]的表達增加小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮通透性，從而促進糖尿病視網(wǎng)膜病變的進展。STAT3與YAP的相互作用為視網(wǎng)膜新生血管形成提供了新的治療靶點。

3.3Hippo通路在角膜中的研究

3.3.1調(diào)節(jié)角膜上皮細胞增殖角膜上皮在受到損傷后，通過局部角膜上皮細胞的增殖和遷移來覆蓋缺損并重建屏障功能，從而修復(fù)損傷。YAP的上游調(diào)節(jié)劑溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)被證明可通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路調(diào)節(jié)角膜上皮細胞增殖，并通過PI3K/AKT途徑促進角膜傷口愈合[68]。此外，Lee等[69]的研究表明，應(yīng)激反應(yīng)蛋白Sesn2的缺乏會增加角膜上皮細胞中活性氧的產(chǎn)生并激活YAP，從而促進角膜上皮細胞增殖。因此，對角膜上皮細胞中的YAP活性進行調(diào)節(jié)有助于促進損傷修復(fù)，而LPA和Sesn2可作為潛在的治療靶點。

3.3.2調(diào)節(jié)角膜緣干細胞增殖角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)有助于維持角膜上皮的穩(wěn)態(tài)[70-71]，是角膜上皮再生的來源，當角膜損傷后增殖活躍以加速修復(fù)損傷[71-72]。Hippo通路的效應(yīng)分子YAP在調(diào)控LSCs增殖分化中具有重要作用。在直徑大于4mm的傷口中，YAP激活介導(dǎo)LSCs的活化和增殖，隨后遷移以封閉缺損的上皮[73]。Gouveia等[74]提出，角膜傷口愈合過程中基質(zhì)變硬，誘導(dǎo)YAP激活以抑制ABCG2的表達[75]，從而促進LSCs分化[76-77]。因此，調(diào)控YAP的活性可促進LSCs介導(dǎo)的角膜上皮修復(fù)。Hou等[78]的研究證明Agrin可以抑制YAP1的磷酸化并調(diào)節(jié)下游cyclin D1的表達，從而促進LSCs的增殖。

3.3.3Hippo通路與角膜疾病除了調(diào)控角膜上皮細胞和LSCs的增殖分化外，Hippo通路在某些角膜疾病中也發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，在圓錐角膜中，Hippo通路(FAT4、LATS2、TEAD2、TEAD4)的mRNA表達水平與非圓錐角膜相比顯著下調(diào)[79]。Zhang等[80]發(fā)現(xiàn)，在小鼠角膜真菌感染期間，差異基因在Wnt、cGMP-PKG和Hippo通路顯著富集。以上研究結(jié)果提示Hippo通路可能在圓錐角膜和真菌性角膜炎的發(fā)病機制中起重要作用，靶向調(diào)控該通路和關(guān)鍵因子可能有助于這些疾病的防治。

綜上，Hippo通路有望成為角膜修復(fù)和再生療法的重要靶點，Hippo通路中的某些分子可能成為角膜感染性疾病或遺傳性疾病診斷和預(yù)后的分子靶標。

3.4Hippo通路在小梁網(wǎng)中的研究既往研究證明，YAP和TAZ在青光眼中隨著小梁網(wǎng)(trabecular meshwork, TM)的彈性硬度的增加而上調(diào)[81]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人類小梁網(wǎng)(hTM)細胞中，LPA及其受體可通過調(diào)節(jié)細胞收縮張力來刺激YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性，并增加CTGF的表達，進而導(dǎo)致ECM的產(chǎn)生增加[82]，也可通過IL-6反式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與YAP、TAZ和STAT3通路相互作用[83]，引起ECM異常重塑從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高[84-85]。而交聯(lián)的ECM又會使β-連環(huán)蛋白和YAP/TAZ功能失調(diào)導(dǎo)致TM變硬[86]。因此，抑制YAP活性可改善hTM細胞中LPA和/或IL-6反式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的高眼壓。miR-137可通過直接靶向Src來阻斷YAP/TAZ的激活，促進細胞生長并抑制hTM細胞中的ECM蛋白表達[87]，因此可能被用作治療青光眼的新靶點。

3.5Hippo通路在葡萄膜中的研究研究表明，YAP/TEAD可通過結(jié)合CD44啟動子激活CD44基因轉(zhuǎn)錄，或者通過激活靶基因轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2[88]，促進脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成[89]。用YAP-siRNA處理顯著降低了小鼠模型中激光誘導(dǎo)的CNV的程度[90]，表明YAP可能是治療CNV的重要分子靶標。超過80%的葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)攜帶GNAQ或GNA11的激活突變[91-92]，其編碼蛋白Gq/11可能通過激活YAP促進葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生[93]，在GNAQ和GNA11突變的脈絡(luò)膜痣中也觀察到下游YAP激活[94]。而YAP抑制劑維替泊芬能選擇性抑制Gq/11突變的葡萄膜黑色素瘤發(fā)生，因此有望成為治療葡萄膜黑色素瘤的分子靶向藥物。

4討論與展望

綜上所述，Hippo通路在眼組織中主要通過激酶級聯(lián)傳遞信號，作用于效應(yīng)分子YAP/TAZ，從而調(diào)控細胞增殖與分化，在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜等組織的發(fā)育、再生中具有重要作用，Hippo通路的異常激活或失活可引起白內(nèi)障、青光眼、角膜和視網(wǎng)膜病變等，但具體致病機制尚不清楚。Hippo通路如何受到眼內(nèi)特有環(huán)境如房水、玻璃體中的因子的調(diào)控？Hippo通路如何與其他信號通路相互作用，調(diào)控眼部組織的生理功能？YAP與何種下游分子相互作用，從而調(diào)控眼部組織特異的基因表達？以上問題有待進一步的研究。闡明Hippo通路在眼部組織中的作用機制，不僅能夠完善現(xiàn)有研究的理論體系，而且有望在眼科臨床中應(yīng)用，例如，Hippo通路中的基因可為某些遺傳性眼部疾病診斷提供預(yù)測，Hippo通路激酶(如LATS、MST)和效應(yīng)分子(YAP/TAZ)可作為某些眼部腫瘤的治療靶點，或成為監(jiān)測某些眼部疾病預(yù)后的指標。因此，Hippo通路在眼科疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。