郭鵬翔 楊扶德 王志旺 龐亞蓉 丁茂鵬 韋凌霞

(1 甘肅中醫(yī)藥大學，蘭州，730000； 2 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，蘭州，730020)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是以慢性氣道炎性為主要病理特征的呼吸系統(tǒng)疾病，而核因子κB及其相關的細胞因子廣泛參與COPD的氣道炎癥反應[1]。黨參具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功，在扶正補虛為COPD基礎治法的中醫(yī)藥理論指導下，黨參及其復方廣泛用于治療COPD，臨床上取得了明顯的療效[2]。本研究采用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)與香煙煙霧提取物來復制COPD動物模型，探討黨參對COPD的治療作用及其對炎癥介質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 70只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性KM小鼠，體質量18～22 g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(甘)2015-0002，設施使用許可證號：SYXK(甘)2015-0005。于甘肅中醫(yī)藥大學科研中心實驗室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22～26 ℃，濕度50%～65%，自然光照，全程小鼠自由進食和飲水，在適應性喂養(yǎng)7 d后進行實驗。本實驗通過甘肅中醫(yī)藥大學科研中心倫理委員會審批(倫理審批號：2020-289)。

1.1.2 藥物 黨參(Codonopsis Radix，CRA)，2019年9月采購于甘肅省渭源縣，經(jīng)本校楊扶德教授鑒定為黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的干燥根。補中益氣丸(濃縮丸)(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：19J95)，醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：200320)。

1.1.3 試劑與儀器 LPS(Sigma公司，美國，批號：039M4004V)；蘭州牌香煙(甘肅煙草工業(yè)有限責任公司，批號：9101703283316736)；卵蛋白(Ovalbumin，OVA)(Grade V Sigma公司，美國，批號：101069301)。白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)及白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(深圳達科為生物技術有限公司，批號：DKW122720、DKW122060、DKW122200)；核因子κB一抗試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-32306R)。鼻部暴露與全身暴露吸入染毒系統(tǒng)(北京廣源達科技發(fā)展有限公司，型號：CHT)；超聲霧化儀(江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司，型號：402AI)；醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號：BI-2000)；光學顯微鏡(Olympus公司，日本，型號：CH-212)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用完全隨機分組法將70只小鼠分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組、補中益氣丸組、黨參高劑量組，黨參中劑量組、黨參低劑量組，每組10只。制備造模液：將3 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)注入香煙煙霧過濾器的液體儲存室，點燃裝在煙嘴上的香煙(去掉過濾嘴)，用吸耳球輕抽吸嘴，香煙煙霧經(jīng)過PBS后被吸出，等香煙距離煙嘴約1 mm時停止抽吸，收集香煙塵霧提取液。將2 mg LPS溶于2 mL香煙塵霧提取液中即得COPD造模液。造模液臨時配置，3 h內使用。

參考相關文獻和預實驗[3-4]，采用鼻內滴注COPD造模液(溶有脂多糖的香煙塵霧提取液)的方法建立COPD小鼠模型。乙醚輕度麻醉小鼠后，將10 μL造模液滴入小鼠鼻腔，1次/d，連續(xù)2周；從第15天開始，滴入鼻腔的造模液增加至15 μL，1次/2 d，連續(xù)2周。

1.2.2 給藥方法 各組小鼠按體質量灌胃給藥，其中空白對照組、模型對照組純凈水(20 mL/kg)灌胃，其余組分別給予地塞米松0.5 mg/kg、補中益氣丸3.6 g(原生藥)/kg，黨參10.4 g/kg、5.2 g/kg、2.6 g/kg。其中黨參藥液是根據(jù)體表面積法、臨床用藥量法并參照預實驗結果制備的，確定黨參小鼠最小有效量為2.6 g/kg，按1∶2的關系設置中、高劑量為5.2 g/kg、10.4 g/kg；按20 mL/kg灌胃給藥時高劑量藥液濃度為52 g/100 mL。取黨參52 g，分別加10倍、8倍量純凈水煎煮60 min、45 min，紗布過濾煎液后靜置6 h，取上清液濃縮至100 mL為高劑量溶液，冷藏供1周內使用，使用前稀釋2倍、4倍為中劑量、低劑量溶液。造模的同時按上述劑量灌胃相應的藥物，1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 COPD行為學觀測 實驗第28天進行支氣管激發(fā)實驗[5]，將小鼠放入吸入染毒系統(tǒng)中，以2 mL/min的速度霧化0.2%組胺和2%乙酰膽堿混合液，將霧氣導入染毒系統(tǒng)，小鼠吸入120 s激發(fā)液后取出，觀察10 min內小鼠連續(xù)抓鼻次數(shù)與連續(xù)撓癢次數(shù)，同時對呼吸異常進行評分。具體評分標準：呼吸正常計0分，呼吸頻率明顯加快者計3分，呼吸頻率明顯加快并伴有煩躁不安者計6分，呼吸頻率明顯加快并伴有腹式呼吸、點頭呼吸者計9分。

1.2.3.2 采集標本、測定指標 測定肺功能后麻醉小鼠、處死，手術游離氣管，結扎左支氣管，PBS灌洗氣管、支氣管及肺泡，收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)，以500×g離心10 min，取上清液測定IL-1β、IL-6及IL-8。摘取肺臟，于固定位置取肺組織2份，第1份肺組織精密稱取濕重，干燥至恒重后稱取干重，計算濕干重比值；第2份肺組織經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋后切片，免疫組織化學染色后觀察核因子κB的表達特點，對其平均光密度值進行定量分析。

2 結果

2.1 黨參對小鼠COPD行為學的影響 經(jīng)觀察，隨著造模時間的延長，模型對照組小鼠抓鼻次數(shù)逐漸最多，部分小鼠出現(xiàn)撓癢動作，實驗后期滴鼻造模15 min后部分小鼠出現(xiàn)呼吸異常。實驗第28天，吸入霧氣組胺與乙酰膽堿混合激發(fā)液后，小鼠連續(xù)抓鼻、撓癢次數(shù)顯著增多，呼吸異常評分值顯著增大，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在黨參的干預下，小鼠連續(xù)抓鼻、撓癢次數(shù)以及呼吸異常評分值明顯降低，與模型對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 黨參對小鼠COPD行為學的影響

2.2 黨參對COPD小鼠肺組織濕干重比值的影響 模型對照組小鼠肺組織濕干重比值顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；在黨參的干預下，肺組織濕干重比值明顯下降，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 黨參對COPD小鼠肺組織濕干重比值的影響

2.3 黨參對COPD小鼠BALF中細胞因子的影響 結果顯示，模型對照組小鼠支氣管BALF中IL-1β、IL-6及IL-8顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；在黨參的干預下，上述異常變化得到了明顯改善，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 黨參對COPD小鼠BALF中細胞因子的影響

2.4 黨參對COPD小鼠肺組織核因子κB表達的影響 在50 μm高倍光鏡下，小鼠肺組織、尤其是氣道壁核因子κB免疫組織化學染色呈紅褐色顆粒狀。對核因子κB半定量分析結果顯示，模型對照組小鼠肺組織核因子κB表達的平均光密度值顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；黨參高劑量組核因子κB表達水平明顯下降，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1，表4。

表4 黨參對COPD小鼠肺組織核因子κB表達的影響

3 討論

COPD是由氣道非特異性炎癥引起的慢性進行性氣道阻塞性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為不完全可逆性的氣流受限，并呈進行性發(fā)展、加重，患者出現(xiàn)氣促、咳痰、喘息，同時常伴有心、肺多種并發(fā)癥[6]。目前我國40歲以上COPD患病率為8.2%，而70歲以上的患病率高達20%，嚴重影響了患者的生命質量[7]。中醫(yī)無COPD之名，根據(jù)臨床癥狀大致屬于“咳嗽”“哮病”“喘證”“肺脹”等范疇，屬于本虛標實之證，尤以正氣虧虛為本病的發(fā)病基礎，臨床上以肺、脾、腎三臟虛證為主，早期多為肺氣虛、脾氣虛，繼而發(fā)展為脾陽虛、腎氣虛，后期發(fā)展為肺、脾、腎三臟俱虛之證[8]。中藥黨參性味甘平而歸脾肺經(jīng)，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功，臨床上用于脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、心悸氣短等癥。在扶正補虛為COPD基礎治法的指導下，黨參及其復方廣泛用于治療COPD，臨床上取得了明顯的療效[2]。

目前，COPD的發(fā)病機制尚不完全明確[9]，可作COPD研究模型的動物尚不固定，由于小鼠的基因序列已經(jīng)明確[10]，飼養(yǎng)成本低，造模存活率高，專用試劑較多，所以最適合用其造模以研究COPD諸多方面問題；脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分[11]，具有趨化作用，可釋放炎癥介質介導肺部炎癥反應，吸煙及二手煙暴露是COPD最基礎的刺激因素[12-13]，而呼吸道感染是COPD發(fā)病的最主要誘發(fā)因素，故目前最常用的COPD動物模型復制物是LPS與香煙煙霧[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，COPD造模過程中大多動物逐漸出現(xiàn)不同程度的咳嗽、噴嚏、鼻分泌物增加、呼吸急促等癥狀[10]，可作為COPD的初步評價指標，決定實驗動物能否進行下一項的評判過程，有重要的參考價值。實驗結果顯示，黨參能明顯減少小鼠連續(xù)抓鼻、撓癢次數(shù)，緩解呼吸異常行為學；同時，黨參能降低肺組織濕干重比值，減輕肺組織炎癥引起的充血水腫而治療COPD。

COPD是慢性氣道炎癥性疾病，作為炎癥調控中心的核因子κB及其相關的細胞因子組成的信號網(wǎng)絡廣泛參與COPD的氣道炎癥反應過程[1]。核因子κB是由p65(RelA)與p50(核因子κB1)2個亞基組成的核轉錄因子，一般情況下核因子κB以非活性的形式存在于細胞質中，在多種上游信號分子的作用下可激活核因子κB信號通路，活化后的核因子κB可加速IL-1β、IL-6及IL-8等多種炎癥介質的表達，產(chǎn)生粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞趨化聚集效應，促使炎癥信號效應進一步放大，因此核因子κB在COPD氣道炎癥反應過程中發(fā)揮關鍵作用[15-16]。由巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1又叫淋巴細胞活化因子[17]，可刺激淋巴細胞黏附于血管內皮細胞并浸潤至氣道上皮組織，加速其脫顆粒而加重氣道炎癥反應。IL-6是一種小分子活性多肽，在COPD中參與氣道急性期炎癥反應蛋白的表達，加速T細胞分化、促進B細胞活化而參與氣道炎癥反應[18]。IL-8又名C-X-C基序配體8，可由巨噬細胞及中性粒細胞分泌，能趨化粒細胞在氣道上皮集聚，引起黏膜下微血管擴張而促進炎癥介質的釋放[19]。本研究結果顯示，黨參能降低COPD小鼠BALF中IL-1β、IL-6及IL-8的水平，抑制肺組織核因子κB的表達，提示下調核因子κB及相關炎癥介質的表達是黨參治療COPD的作用機制之一。