方向東

（湖南省桂東縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，湖南 桂東 423500）

菌種培育作為食用菌生產(chǎn)的基礎(chǔ)在食用菌產(chǎn)業(yè)中尤為重要。相對于固體菌種，液體菌種是指通過液體培養(yǎng)基經(jīng)無菌培養(yǎng)得到的菌絲體或菌種。而液體菌種具有純度高、活力強(qiáng)，接種后萌發(fā)點(diǎn)多，發(fā)菌快，縮短菌種發(fā)菌時(shí)間，成本低，可增加栽培批次，為食用菌集約化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)創(chuàng)造了條件等優(yōu)點(diǎn)，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及技術(shù)的提升越來越突出，因此液體菌種被越來越多的生產(chǎn)企業(yè)所接受。但同時(shí)液體菌種技術(shù)推廣存在培養(yǎng)基配制設(shè)備、搖瓶菌種設(shè)備、液體菌種培養(yǎng)設(shè)備及接種設(shè)備等設(shè)備投入大對小規(guī)模生產(chǎn)農(nóng)戶存在一定的困難；人員素質(zhì)要求相對較高；技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)高及品質(zhì)鑒定難等不足。為克服和解決食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)上諸多制約因素與困難，降低液體菌種生產(chǎn)技術(shù)門坎，便于液體菌種在食用菌生產(chǎn)上廣泛推廣與應(yīng)用，筆者在對本地野生牛肝菌（桂東黃菌、內(nèi)緣牛肝菌）馴化栽培試驗(yàn)中，開展了大量液體菌種培養(yǎng)試驗(yàn)。然而，在牛肝菌馴化栽培液體菌種制備與生產(chǎn)中，常因設(shè)備簡陋滅菌消毒不徹底造成雜菌感染而失敗，為破解因設(shè)備不足、滅菌消毒操作達(dá)不到要求等問題，受張宗舟、張揚(yáng)等人的啟發(fā)，及借鑒貴州宏寶食用菌科技開發(fā)有限公司開發(fā)的“食用菌簡易液體菌種制作新模式”（液體菌種簡易制作新技術(shù)_騰訊視頻 https://v.qq.com/x/page/t3227wjx1tm.html），設(shè)想是否可以通過在液體菌種培養(yǎng)液中添加防霉劑，探尋出一種新型的精簡食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)。經(jīng)過多批次試驗(yàn)，在食用菌液體菌種培養(yǎng)液中添加山梨酸、苯甲酸鈉、丙酸鈣、富馬酸、富馬酸二甲酯等防霉劑多配方方案進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)試驗(yàn)后，得出了在食用菌液體菌種培養(yǎng)液中添加0.02%富馬酸二甲酯進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)緣牛肝菌菌種發(fā)育良好、雜菌率低的結(jié)果。此試驗(yàn)的成功，可以在食用菌液體菌種生產(chǎn)中達(dá)到發(fā)揮液體菌種優(yōu)勢、彌補(bǔ)液體菌種缺點(diǎn)的效果，該技術(shù)既降低了液體菌種生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)技術(shù)、資金投入等準(zhǔn)入門坎，簡化了生產(chǎn)流程，降低了生產(chǎn)成本，又可以實(shí)現(xiàn)滿足批量或小型種植戶自繁自用的需求，在食用菌科研與生產(chǎn)中頗具現(xiàn)實(shí)意義，現(xiàn)將有關(guān)技術(shù)操作與要點(diǎn)作簡要介紹，供廣大食用菌科研生產(chǎn)工作者參考。

1.材料與方法

1.1 采用的設(shè)備及工具。采用的設(shè)備主要來源于家庭日常用具，包括：不銹鋼鍋、電磁爐或燃?xì)庠?、壓力鍋、天平、秤、量杯、油桶等窄口液體容器、魚缸增氧氣泵、漏斗、長40cm左右木棒、接種刀等常用接種工具、酒精燈、220V定時(shí)插座等。

1.2 備用材料。2mm厚度土工布、紙巾、紗布、6mm膠管及調(diào)節(jié)閥、高錳酸鉀、碘伏、新鮮內(nèi)緣牛肝菌子實(shí)體等。

1.3 培養(yǎng)液基礎(chǔ)材料及配方。水86.6%，馬鈴薯8%，紅糖1.2%，葡萄糖0.8%，麥麩2.4%，蛋白胨0.12%，磷酸二氫鉀0.12%，硫酸鎂0.06%，維生素B10.08%，白醋0.4%，消泡劑0.2%。

1.4 添加防霉劑試驗(yàn)方法。將山梨酸、苯甲酸鈉、丙酸鈣、富馬酸、富馬酸二甲酯等防霉劑按不同劑量添加到上述培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)，使用同樣的處理方式設(shè)置三次重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，在室溫24-28℃下培養(yǎng)15天后對培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，采用量杯對過濾出來的液體菌種菌絲數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同防霉劑及不同劑量見表1。

表1 不同防霉劑劑量（占培養(yǎng)液百分比）

1.5 試驗(yàn)操作工藝流程。清潔用具→配制培養(yǎng)液→培養(yǎng)液高溫高壓滅菌→培養(yǎng)液冷卻→灌裝混合液到油桶→接種箱及接種工具滅菌消毒→新鮮食用菌子實(shí)體制作接種菇塊。（可以采用食用菌母種或原種代替，如采用母種或原種接種可以跳過本操作）→接種→靜置培養(yǎng)→增氧泵增氧帶攪動培養(yǎng)。

1.6 操作工藝流程解析

1.6.1 清潔用具。清潔用具時(shí)可用自來水、泉水等相對清潔的水清洗，對有污垢的用具要用清洗刷或清潔球進(jìn)行擦拭，直至無污垢后即可，對有油污的用具要用清潔劑進(jìn)行清洗，直至無油污即可，清洗后用0.05%高錳酸鉀溶液等消毒液擦拭一遍或浸泡30分鐘-40分鐘，然后倒掉消毒液備用。

1.6.2 配制培養(yǎng)液。先按培養(yǎng)液配方用天平或秤稱取所需物質(zhì)備用，在配制培養(yǎng)液時(shí)先將馬鈴薯切成薄片，倒入事先準(zhǔn)備好的不銹鋼鍋中，隨后把麥麩倒入鍋中，按比例加足水，在電磁爐或燃?xì)庠钌现蠓泻蟪掷m(xù)煮30分鐘，用2層醫(yī)用紗布捆扎在高壓鍋口上，把煮沸過的土豆、麥麩混合物往高壓鍋里倒，過濾掉土豆、麥麩渣形成棕色清液，然后往高壓鍋內(nèi)加入其它配料并用棍棒攪拌3分鐘至配料溶化。

1.6.3 培養(yǎng)液高溫高壓滅菌。培養(yǎng)液在高壓鍋內(nèi)加熱至高壓鍋額定壓力后保持壓力60分鐘實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液高溫高壓滅菌。

1.6.4 培養(yǎng)液冷卻。讓高壓鍋內(nèi)培養(yǎng)液在室溫下自然冷卻至25-30℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 灌裝混合液。將上述培養(yǎng)液用膠管采取虹吸方式灌裝到油桶中，灌裝到油桶容量的60%即可，每灌好一桶即取一段長40cm左右的增氧泵膠管用紙巾卷起制作成油桶瓶塞，塞住油桶口，伸入油桶內(nèi)的膠管底端要捆扎一個(gè)略重的墜子，確保能插到油桶底部而且在增氧充氣時(shí)不上浮，紙巾做成的塞子要松緊適度，以肉眼看不到孔洞又能塞在瓶口不往下掉即可，混合液體在灌裝過程中應(yīng)盡量只揭開高壓鍋蓋一條小縫，避免不必要的混雜空氣進(jìn)入桶內(nèi)。注意在材料煮和壓力鍋消毒時(shí)損失的水分在灌裝時(shí)用30℃左右的溫開水進(jìn)行補(bǔ)充。

1.6.6 接種箱及接種工具滅菌消毒。接種工具全部移入接種箱，接種箱及接種工具按常規(guī)方法進(jìn)行滅菌消毒，可以采取臭氧法滅菌30分鐘，也可以采取紫外線照射滅菌40分鐘。

1.6.7 新鮮食用菌子實(shí)體制作接種菇塊（如采用母種或原種接種可以跳過此操作過程）。選取新鮮無蟲害無腐爛未全開的健壯食用菌作種菇，首先，將新鮮食用菌子實(shí)體切除帶泥菇腳和有蟲駐孔部分，移入已消毒的接種箱內(nèi)后用碘伏浸泡20分鐘，或用棉簽沾碘伏通體擦拭一遍后靜置20分鐘進(jìn)行滅菌消毒。然后將已滅菌消毒處理過的食用菌子實(shí)體用接種刀切成5mm左右大小的塊狀菇塊。

1.6.8 接種。按照常用接種方法進(jìn)行接種，將裝有培養(yǎng)液的油桶置于接種箱內(nèi)，揭開瓶塞倒入切好的菇塊10小塊或5mm左右大小的母種（或原種）8小片倒入桶中，塞回瓶塞即可移出接種箱完成接種。

1.6.9 靜置培養(yǎng)。將接種好的裝有培養(yǎng)液的油桶放置在溫度24-30℃的室內(nèi)靜置培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察接種的菌種長出絨毛狀菌絲后即已完成靜置培養(yǎng)階段。

1.6.10 增氧泵增氧及氣流攪動培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)后觀察油桶內(nèi)菌種已萌發(fā)新菌絲出來后，即可接入增氧泵通氣增氧了，增氧充入空氣過程中形成對流可對培養(yǎng)液形成攪動作用，把增氧泵放入60cm見方的水果框中，用2mm厚的無紡布包裹圍實(shí)水果框，對吸入的空氣進(jìn)行過濾，此流程應(yīng)提前1天打開增氧泵對水果框內(nèi)空間進(jìn)行預(yù)凈化，增氧泵插頭連接在定時(shí)插座上，定時(shí)插座設(shè)置開20分鐘停30分鐘循環(huán)狀態(tài)，培養(yǎng)環(huán)境溫度在24-30℃為宜，最適宜溫度27℃，若環(huán)境溫度低于24℃或高于30℃應(yīng)采取一些增溫或降溫措施，增氧攪動培養(yǎng)一般在15天左右即可完成。

2.結(jié)果與分析

2.1 不同劑量防霉劑對雜菌和食用菌菌絲生長影響結(jié)果

不同防霉劑不同劑量在液體菌種培養(yǎng)中，表現(xiàn)出對抑制雜菌、食用菌菌絲生長表現(xiàn)各異，其作用主要通過培養(yǎng)出的食用菌菌絲數(shù)量多少來鑒定，培養(yǎng)15天后的三次重復(fù)的測定結(jié)果見表2、表3、表4。

表2 一次重復(fù)不同防霉劑劑量培養(yǎng)的食用菌菌種數(shù)量

表3 二次重復(fù)不同防霉劑劑量培養(yǎng)的食用菌菌種數(shù)量

表4 三次重復(fù)不同防霉劑劑量培養(yǎng)的食用菌菌種數(shù)量

2.2 分析

2.2.1 從表2、表3、表4的數(shù)據(jù)可以很直觀地看出，添加富馬酸二甲酯的處理與其它處理表現(xiàn)出極其明顯的差異性，添加防霉劑富馬酸二甲酯的處理隨著添加劑量的增加抑制雜菌能力增強(qiáng)，在添加劑量為占培養(yǎng)液的0.02%時(shí)表現(xiàn)非常突出，富馬酸二甲酯有效抑制了雜菌生長，凈化與維護(hù)了食用菌菌絲生長環(huán)境，食用菌菌絲得以實(shí)現(xiàn)正常生長，隨著劑量繼續(xù)增加時(shí)對食用菌菌絲生長影響也明顯增強(qiáng)。

2.2.2 在未嚴(yán)格進(jìn)行滅菌消毒的培養(yǎng)液中進(jìn)行食用菌菌絲培養(yǎng)時(shí)，食用菌菌絲與雜菌是共存的，食用菌菌絲與雜菌是一種競爭關(guān)系，相互之間是此消彼長的關(guān)系，從三次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出，不同防霉劑對雜菌和食用菌都有一定的抑制作用，在添加低劑量防霉劑或不添加防霉劑的對照處理中，雜菌繁殖能力與增殖速度快，而食用菌菌絲生長能力與增殖速度遠(yuǎn)不及雜菌，在雜菌沒有得到有效抑制的情況下食用菌菌絲難以生長甚至接種萌發(fā)不成功。

2.2.3 在添加高劑量防霉劑的培養(yǎng)液中，食用菌菌絲將完全被抑制生長。

3.討論

3.1 食用菌液體菌種培養(yǎng)中在某些藥劑適當(dāng)劑量的輔助作用下，是可以實(shí)現(xiàn)較粗放滅菌情況下食用菌菌絲正常生長的。在內(nèi)緣牛肝菌液體菌種培養(yǎng)中，添加占培養(yǎng)液0.02%比例的富馬酸二甲酯，由于富馬酸二甲酯的抑菌作用，雜菌得到有效抑制，內(nèi)緣牛肝菌液體菌種菌絲生長良好，雜菌率很低對大田生產(chǎn)影響甚微，可以在該食用菌試驗(yàn)與生產(chǎn)中加以應(yīng)用。

3.2 本試驗(yàn)不同之處，一是在食用菌液體菌種生產(chǎn)中利用富馬酸二甲酯獨(dú)特的抑菌效果，在食用菌液體菌種培養(yǎng)液中添加適當(dāng)劑量的富馬酸二甲酯抑制雜菌生長的同時(shí)為食用菌生長提供了有利的生長環(huán)境；二是簡化了液體菌種生產(chǎn)流程，如在食用菌液體菌種生產(chǎn)中可以直接使用食用菌子實(shí)體進(jìn)行接種，使用的用具和材料及所處環(huán)境無需進(jìn)行嚴(yán)格滅菌消毒等方面；三是在食用菌液體菌種生產(chǎn)中可以充分利用家庭常用設(shè)備和用具，無需購置搖床、培養(yǎng)罐等專用食用菌液體菌種生產(chǎn)設(shè)備，大大降低了食用菌生產(chǎn)設(shè)備、技術(shù)與投入門坎和生產(chǎn)成本，生產(chǎn)規(guī)模也可以依據(jù)生產(chǎn)者需求自主可控，有利于有適宜條件有發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)意愿的廣泛農(nóng)戶參與到食用菌產(chǎn)業(yè)中來，為提高農(nóng)民收入多了一些可選擇的產(chǎn)業(yè)發(fā)展路子。

3.3 不同的食用菌對藥劑的選擇及劑量要求有待進(jìn)一步試驗(yàn)，除了在食用菌液體菌種試驗(yàn)與生產(chǎn)上之外，在固態(tài)食用菌菌種生產(chǎn)及大田生產(chǎn)中也有一定借鑒意義。