包濤濤，汪忠榮，吳通奎，楊先富，彭彩麗，楊政益

(黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 凱里 556000)

鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)屬于細(xì)小病毒科依賴(lài)病毒屬成員，為水禽鵝瘟(又稱(chēng)小鵝瘟、鵝腸炎、鵝肝炎及鵝傳染性心肌炎)病原[1]，主要侵害3～20日齡雛鵝及番鴨，通常不感染其他品種鴨，致病率和致死率較高[2]。GPV最早由中國(guó)著名微生物學(xué)家方定一[3]于1956年在江蘇揚(yáng)州首先發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多年研究，我國(guó)成功研制出小鵝瘟種鵝弱毒疫苗、雛鵝弱毒疫苗及高免血清，使該病得到了較好的控制[4]。但自2015年以來(lái)，我國(guó)華東地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)櫻桃谷鴨及半番鴨以生長(zhǎng)遲緩，短頸，短喙，舌外露，胸骨及翅、腿易發(fā)生骨折等最終定義臨床癥狀為“短喙-侏儒綜合征”(Short beak and dwarfism syndrome，SBDS)的疾病[5-9]，陳浩[5]和李傳峰[9]鑒定出引起該病的主要病原為新型鵝細(xì)小病毒(Novelgooseparvovirus，NGPV)。與典型GPV相比，NGPV所引起的致死率較低，通常低于3%，但僵鴨淘汰率則高達(dá)80%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[10]。本文就新型鵝細(xì)小病毒病的病原特征、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢及診斷方法做一概述，以期為該病的防治提供參考依據(jù)。

1 病原學(xué)

1.1 病原介紹

水禽細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科依賴(lài)病毒屬，單鏈DNA結(jié)構(gòu)，主要包含鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)及番鴨細(xì)小病毒(MuscovyDuckParvovirus，MDPV)，前者主要感染雛鵝和雛番鴨，而后者僅能感染雛番鴨[11]。此外，兩者在病毒的大小、形態(tài)及基因組的結(jié)構(gòu)十分相似，發(fā)病癥狀也極其相似。電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示GPV與MDPV的病毒粒子形態(tài)包含空心及實(shí)心兩種，無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)，正二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑20～24nm，由32個(gè)管狀排列殼粒共同組成衣殼[10]。

1.2 基因組

GPV、NGPV及MDPV三者基因組序列基本相似，大小約5.1kb，5′端折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾形似“箭”狀，在其兩端存在著相同末端重復(fù)序列，長(zhǎng)度約440bp，該結(jié)構(gòu)與ITR對(duì)病毒復(fù)制起著至關(guān)重要的作用[10]。發(fā)夾分別由約180nt及45nt的“莖”和“泡”組成，“箭”形狀上還包含限制性?xún)?nèi)切酶Sph I的酶切位點(diǎn)，為ITR對(duì)稱(chēng)中心，ITR還包含數(shù)個(gè)4～10bp的重復(fù)序列。此外，它們的基因組主要包含兩個(gè)開(kāi)放式閱讀框(Open reading frame，ORF)，兩側(cè)ORF之間間隔18bp，左側(cè)ORF主要參與非結(jié)構(gòu)蛋白NS1及NS2編碼(NS1與NS2共用一個(gè)終止子且NS1﹥NS2)，右側(cè)ORF主要參與結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2及VP3編碼(VP1、VP2與VP3共用一個(gè)終止子且VP1﹥VP2﹥VP3)[12]，編碼GPV的NS及VP基因全長(zhǎng)分別為1884bp和2199bp[13]。非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)蛋白則是病毒的衣殼組成成分。研究者對(duì)2015年以來(lái)分離出的7株典型NGPV進(jìn)行全基因組核苷酸同源性比對(duì)，其同源性介于99.2%～99.7%；與2012年分離的GPV經(jīng)典株LH相比，其同源性介于93.4%～95.2%；而與2015年分離的MDPV毒株P(guān)1進(jìn)行比對(duì)，其同源性介于81.3%～83.4%[10]。為研究GPV與NGPV兩者之間的關(guān)系，LI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，兩者之間核苷酸同源性介于92.2%～97.1%，且NGPV為GPV的一個(gè)分支，與經(jīng)典GPV毒株的基因序列相比，NGPV在反向末端重復(fù)序列處有5個(gè)核苷酸突變，也有部分NGPV毒株存在2處堿基缺失，其復(fù)制及衣殼蛋白分別發(fā)生在8及12個(gè)同步氨基酸的變化，這些很有可能與病毒的基因調(diào)控、體液免疫及宿主的轉(zhuǎn)移有著密切重要的關(guān)系。

2 流行病學(xué)

通常GPV僅感染雛鵝及雛番鴨，而對(duì)其他鴨并不易感，隨著動(dòng)物日齡的增加，動(dòng)物的易感性逐漸減弱。GPV傳播方式較多，直接接觸、間接接觸及垂直傳播均被認(rèn)為是其常見(jiàn)的傳播方式，病毒主要侵害4～20日齡雛鵝，7日齡以?xún)?nèi)的雛鵝病死率可達(dá)100%，10日齡以上的病死率一般低于60%。2015年，我國(guó)華東地區(qū)的櫻桃谷鴨出現(xiàn)一種以SBDS為主要癥狀的疾病，患病鴨體重明顯低于健康鴨，從而導(dǎo)致出欄合格率下降，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。陳浩[5]最先公開(kāi)報(bào)道從患病櫻桃谷肉鴨體內(nèi)分離出病原，并通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)櫻桃谷肉鴨所感染的是一種新型GPV即NGPV，緊接著國(guó)內(nèi)又有不少研究報(bào)道，鵝細(xì)小病毒感染范圍已經(jīng)擴(kuò)大，已不再是單純感染雛鵝及番鴨，而且典型臨床癥狀也發(fā)生了變化。李傳峰[9]從華東地區(qū)以SBDS為主要臨床癥狀的患病鴨組織中檢測(cè)出了與GPV類(lèi)似的特異性核酸，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及免疫組化檢測(cè)分析，證實(shí)檢測(cè)病原與GPV存在著病毒特異性抗原；李亞非[15]采用PCR技術(shù)從有SBDS癥狀鴨體內(nèi)擴(kuò)增出GPV VP3基因，發(fā)現(xiàn)其與現(xiàn)有報(bào)道櫻桃谷鴨感染的NGPV核苷酸同源性最高。隨后，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)關(guān)于病鴨感染NGPV的報(bào)道也逐漸增多，該病似乎在各地鴨群中正逐步形成流行趨勢(shì)。

3 臨床癥狀及病理變化

臨床癥狀上[10]，由NGPV感染鴨所引起的典型臨床癥狀一般表現(xiàn)為短喙、鴨舌腫大、舌外露、脛骨變短、發(fā)育遲緩、腹瀉及翅、腿易折等。GPV與MDPV感染動(dòng)物所引起的典型癥狀一般可分為最急性、急性及亞急性3種類(lèi)型。最急性型：多發(fā)于6日齡以?xún)?nèi)的番鴨，病程短，患鴨不出現(xiàn)任何前期癥狀便可急性死亡；急性型7～14日齡番鴨較為易發(fā)，病程一般2～4d，前期表現(xiàn)為精神萎靡、腹瀉、呼吸困難、腿腳無(wú)力及厭食等；亞急性型多發(fā)于14日齡以上的番鴨，病程5～7d，其臨床癥狀與急性型臨床癥狀較為類(lèi)似。

病理變化上，感染NGPV的病鴨鴨舌出現(xiàn)間質(zhì)性炎癥，舌部結(jié)締組織水腫、疏松，胸腺略帶出血，肝臟及脾臟輕微萎縮，肺臟充血、出血，腎小管出血、水腫，胰腺針尖大小樣出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而感染GPV與MDPV的動(dòng)物所表現(xiàn)的典型病理變化主要為滲出性腸炎，胰臟蒼白壞死，腸黏膜充血、出血，膽囊腫大，心肌束間有紅細(xì)胞滲出，肝細(xì)胞局部有顆粒及脂肪變性，神經(jīng)細(xì)胞輕度變性及膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生等。

4 診斷方法

GPV常用的檢測(cè)方法主要包含病毒中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散抑制試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳、免疫酶斑點(diǎn)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、膠體金免疫層析技術(shù)、普通PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等[16]。臨床診斷上可結(jié)合實(shí)際情況有針對(duì)性地選擇對(duì)應(yīng)的診斷方法開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。為克服瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)技術(shù)敏感性差的弊端，秦愛(ài)建等[17]使用GPV酶標(biāo)單克隆抗體建立了一種可用于GPV檢測(cè)的免疫酶瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)技術(shù)。邱平等[18]使用FITC標(biāo)記的小鵝瘟單抗，建立了一種在2 h內(nèi)便可檢測(cè)出GPV的直接免疫熒光試驗(yàn)技術(shù)。郭卉等[19]也利用試驗(yàn)制備的單克隆抗體，建立了一種可用于GPV檢測(cè)的間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù)。

目前，關(guān)于GPV VP基因的報(bào)道文獻(xiàn)很多，VP3作為GPV VP基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白序列保守穩(wěn)定，所以，研究者常以VP3作為GPV的分子生物學(xué)診斷依據(jù)。國(guó)內(nèi)早已有學(xué)者根據(jù)GPV及MDPV VP3基因設(shè)計(jì)一對(duì)GPV特異引物，建立了一種針對(duì)2種病毒PCR快速鑒別診斷方法，可以特異性地區(qū)分GPV與MDPV[19]。此外，張穎等[20]及呂亞楠等[21]也針對(duì)GPV的VP3基因序列各自設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，成功建立了一種用于快速檢測(cè)GPV的分子生物學(xué)方法，可應(yīng)用于開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)的快速檢測(cè)。

高莎莎等[22]根據(jù)NGPV的保守序列設(shè)計(jì)不同的引物，分別建立半套式PCR、套式PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法，可用于NGPV的診斷檢測(cè)。YANG等[23]建立了一種可快速用于NGPV檢測(cè)的LAMP方法，該方法最低檢出量為100copies，具有較高靈敏度，是普通PCR的100倍。鄭肖強(qiáng)等[24]制備N(xiāo)GPV的一種地高辛標(biāo)記探針，該探針與鴨的其他病毒反應(yīng)結(jié)果均為陰性，最低檢出量為25pg。LI等[8]建立一種可檢測(cè)經(jīng)典GPV及NGPV的雙重半巢式PCR方法，經(jīng)臨床檢測(cè)，結(jié)果顯示在所有具有短喙侏儒綜合癥狀的鴨病料中可以檢出NGPV陽(yáng)性，而其余的病料中則并未檢測(cè)出經(jīng)典GPV，這與GPV在臨床上只感染鵝及番鴨的結(jié)果也是相符的。

5 小結(jié)

鴨“短喙-侏儒綜合征”是一種近年來(lái)在養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)生的重要新型病毒性疾病，患病鴨體重明顯低于健康鴨，導(dǎo)致養(yǎng)鴨場(chǎng)出欄合格率顯著下降，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)動(dòng)物疫病防控使命極其艱巨，目前，我國(guó)已研制出可控制GPV所致疾病的弱毒疫苗及高免血清等生物制品，同時(shí)，也有報(bào)道稱(chēng)目前典型GPV疫苗在一定程度上可以預(yù)防NGPV的發(fā)生，但根據(jù)最新研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，該病毒仍在變異中，傳統(tǒng)小鵝瘟疫苗和抗體很有可能面臨失效的風(fēng)險(xiǎn)。故針對(duì)現(xiàn)發(fā)且廣泛流行的NGPV疾病，一方面需要加快疫苗及快速診斷試劑的研發(fā)，另一方面要加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境衛(wèi)生消毒及生物安全等疫病防控工作，多方面協(xié)同運(yùn)作共同防控新發(fā)疾病。