張國明 丁立成 孫廣峰 留志賢 王斌 孫媛媛

（廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院 福建 廈門 361009）

隨著急診冠脈介入治療的發(fā)展，缺血再灌注損傷已經(jīng)成為急性心肌梗死治療最后的堡壘，細(xì)胞凋亡是引起心肌組織缺血再灌注損傷的主要因素[1]，因此，抑制再灌注時細(xì)胞凋亡能夠有效防治心肌缺血再灌注損傷。多項研究已經(jīng)證實缺血后適應(yīng)可有效降低心肌細(xì)胞凋亡，但鑒于臨床使用的局限性，有很多學(xué)者提出了遠(yuǎn)隔器官適應(yīng)，即肢體遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)[2]，能夠有效減少實驗大鼠心肌梗死面積，以減輕再灌注使對心肌組織的損害。但是目前臨床或動物實驗研究中，尚無標(biāo)準(zhǔn)的遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)方案，遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)效果與心肌缺血發(fā)生后至適應(yīng)開始的時間、適應(yīng)處理過程中每次短暫缺血-灌注時間及其循環(huán)次數(shù)等因素密切相關(guān)[3]。鑒于損傷和治療中漸進模式能減緩變化過程，從而給予此變化過程一個緩沖的理念，本研究提出了漸進遠(yuǎn)隔時適應(yīng)的概念。本研究選取60 只實驗大鼠開展分組研究，以探析遠(yuǎn)隔缺血時不同適應(yīng)漸進模式對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌的保護作用?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料 60 只SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，自由飲食水，飼養(yǎng)室內(nèi)溫濕度適宜，12 h/12 h 明暗周期環(huán)境。TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒（北京微旋基因技術(shù)有限公司）；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道（MPTP）檢測試劑盒（滬震生物）；VIS-721N 紫外可見光光度計（棱光）；單克隆抗體信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（p-STAT3）、單克隆抗體JAK 激酶2（p-JAK2）、蛋白激酶B 單克隆抗體（p-AKT）、單克隆抗體信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）（艾美捷科技）。

1.2 試驗分組 采用隨機數(shù)字表法，將60 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血/再灌注對照組、標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組、標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組、正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組、負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組六組，每組10只。

1.3 心肌缺血-再灌注損傷模型建立 心肌缺血再灌注損傷大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（70 mg/kg），頸部皮膚常規(guī)消毒，縱向切開暴露第2 和第3 個氣管環(huán)。行氣管切開術(shù)，氣管插管，連接呼吸機。機械通氣參數(shù)設(shè)置為，呼吸頻率65 次/min，潮氣量2.5 ml/100 g，呼吸比1:1。然后在大鼠右后肢和左前、后肢放置心電圖電極進行心電圖監(jiān)測。同時充分暴露大鼠右側(cè)頸總動脈，插入22G 套管針并連接動脈壓儀，連續(xù)測量大鼠頸動脈血壓。將大鼠左側(cè)胸壁消毒，從胸骨左緣沿胸骨方向切開皮膚至第5 肋間水平，鈍性分離并切至第4 肋間肌。撕開心包顯露心臟，5-0 縫線從左心耳中點下緣進入左冠狀動脈前降支左側(cè)，從右側(cè)出針，深度1 mm。然后在縫合線的兩端各穿一根1 cm 的縫合線，以防止縫合線脫落。在心肌表面與縫合線之間放置1 mm 棉包肝素鹽水，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。再向下推連接管，用棉絮壓左冠狀動脈前降支，用血管鉗阻斷左冠狀動脈前降支的血流，實現(xiàn)缺血。松開血管鉗可恢復(fù)冠狀動脈左前降支再灌注。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 假手術(shù)組 假手術(shù)組大鼠建模，但常規(guī)開胸后分離左冠狀動脈和左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎，40 min 后關(guān)閉大鼠胸腔。

1.4.2 缺血/再灌注對照組 冠脈實施40 min 缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組 冠脈實施40 min 球囊阻塞缺血后，每隔30 s 松開阻塞球囊30 s，共3 次，至恢復(fù)完全再灌注；分離左側(cè)股動脈并穿線后不結(jié)扎。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組 冠脈實施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時結(jié)扎股動脈5 min，而后再灌注5 min，反復(fù)進行4 個循環(huán)。

1.4.5 正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組 冠脈實施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時結(jié)扎股動脈1 min，而后再灌注4 min。而后按照2/3 min、3/2 min、4/1 min、4/1 min、3/2 min、2/3 min、1/4 min反復(fù)進行8 個循環(huán)。

1.4.6 負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組 冠脈實施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注；分離左側(cè)股動脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時結(jié)扎股動脈4 min，而后再灌注1 min。而后按照3/2 min、2/3 min、1/4 min、1/4 min、2/3 min、3/2 min、4/1 min反復(fù)進行8 個循環(huán)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 比較各組大鼠心肌梗死范圍 各組大鼠予以相應(yīng)干預(yù)后，在其左心室推注4 ml 伊文思藍(lán)以對心臟非缺血區(qū)（藍(lán)色）和缺血危險區(qū)（無藍(lán)色）進行鑒別。經(jīng)大鼠右頸總動脈注射10%氯化鉀溶液2 ml 將大鼠處死，即刻取出心臟，沖洗干凈并剪除右心室、右心房，冰凍20 min，左心室從心尖到心底橫向切片。置于0.05%NET 磷酸鹽溶液中浸泡20 min，再用4%多聚甲醛固定。拍照計算梗死范圍，即梗死面積之和占總面積的比值。

1.5.2 比較各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率 采用TUNEL 法，用TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格根據(jù)說明書進行操作。凋亡率為每張切片中凋亡心肌細(xì)胞個數(shù)占所有心肌細(xì)胞個數(shù)的比值。

1.5.3 比較各組大鼠心肌組織MPTP 開放程度 先用差速離心法將心肌組織線粒體提取出來，再用紫外可見光光度計測量吸光度初值（△A1），予以MPTP 檢測試劑盒誘導(dǎo)MPTP 開放，再次測量吸光度值（△A2）。MPTP 開放程度由△A 表示，△A=△A1-△A2該值愈小，提示開放程度愈大[4]。

1.5.4 比較各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表達(dá)水平 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，兩組對比用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死范圍、 心肌細(xì)胞凋亡率及MPTP 開放程度比較 與缺血/再灌注對照組相比，標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組、標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組、正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組、負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組的心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率更低，△A 值顯著升高；且正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率低于其他組，△A 值顯著高于其他組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率及MPTP 開放程度比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血/再灌注對照組比較，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組比較，△P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組比較，▲P＜0.05；與負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組比較，▽P＜0.05。

組別 n 心肌梗死范圍（%） 心肌細(xì)胞凋亡率（%） △A假手術(shù)組缺血/再灌注對照組標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組10 10 10 10 10 10 FP 6.78±0.63 29.08±2.73*17.08±1.80*#17.20±1.64*#15.14±1.25*#△▲▽18.39±0.87*#190.280 0.000 5.84±0.71 26.19±3.23*17.04±2.04*#16.65±2.32*#13.06±0.94*#△▲▽16.63±2.01*#102.631 0.000 0.37±0.02 0.13±0.02*0.21±0.03*#0.26±0.02*#△0.30±0.02*#△▲▽0.26±0.03*#△127.384 0.000

2.2 各組大鼠心肌組織p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、 p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較 蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表達(dá)水平較假手術(shù)組外的其他組顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血/再灌注對照組比較，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組比較，△P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組比較，▲P＜0.05；與負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組比較，▽P＜0.05。

組別 n p-STAT3 p-JAK2 p-AKT p-ERK1/2假手術(shù)組缺血/再灌注對照組標(biāo)準(zhǔn)機械后適應(yīng)組標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組負(fù)向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組10 10 10 10 10 10 FP 1.22±0.09 0.29±0.04*0.61±0.07*#0.63±0.10*#0.82±0.07*#△▲▽0.63±0.06*#173.713 0.000 1.07±0.10 0.23±0.03*0.41±0.07*#0.38±0.06*#0.47±7805*#△▲▽0.41±0.05*#215.768 0.000 0.44±0.02 1.41±0.06*1.90±0.13*#1.86±0.09*#2.03±0.08*#△▲▽1.89±0.08*#508.525 0.000 0.64±0.08 1.79±0.12*2.29±0.12*#2.32±0.13*#2.48±0.11*#△▲▽2.34±0.14*#350.308 0.000

3 討論

急性心肌梗死后的缺血再灌注損傷是困擾臨床工作的重要難題之一，其機制主要是再灌注后心肌組織內(nèi)釋放大量氧自由基、中性粒細(xì)胞浸潤，致使心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，心肌組織受損[5]。2003 年Zhao 等[6]學(xué)者提出缺血后處理概念，即在冠脈再灌注治療開始時實施短暫性的、反復(fù)開通以及再關(guān)閉，逐漸恢復(fù)冠脈血流，這對于改善心肌組織再灌注損傷有顯著的效果。但缺血后適應(yīng)在臨床應(yīng)用過程中窗口期較短，且冠脈局部處理在手術(shù)過程中存在一定風(fēng)險，因此有學(xué)者提出了在其他部位進行后處理的方法，即遠(yuǎn)隔適應(yīng)。

有研究[7]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)與遠(yuǎn)隔缺血后處理對心肌缺血再灌注損傷的心肌保護作用相似。遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)主要是在心肌組織發(fā)生缺血后，且在心肌再灌注治療前實施干預(yù)措施，給臨床治療提供了足夠的操作時間，且具有良好的安全性。最新臨床薈萃分析[8]顯示，遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)能夠降低急性心肌梗死病人心肌標(biāo)記物水平，從而改善預(yù)后。也有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)處理過程中短暫性灌注、短暫性缺血的時間關(guān)系是可相互影響的。鑒于所有的病理損傷和治療過程如果給予漸進處理，都會為變化過程帶來緩沖，從而可以減弱不良反應(yīng)的理念，本研究對不同遠(yuǎn)隔缺血時適應(yīng)漸進模式進行比較，結(jié)果顯示，正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組的心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于假手術(shù)組外的其他組，因為正向漸進模式在缺血和再灌注兩個階段都提供了正向的漸進過程，從宏觀上講更符合漸進適應(yīng)的過程。

在具體機制方面，再灌注損傷補救激酶（RISK）、生存活化因子增強（SAFE）途徑和線粒體途徑是心肌缺血-再灌注損傷發(fā)生的主要信號通路[10～11]。其中，RISK 信號通路磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）主要通過激活下游效應(yīng)器，以降低再灌注損傷引起細(xì)胞凋亡發(fā)生。SAFE 信號通路在心肌缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著保護作用，主要通過介導(dǎo)JAK2/STAT3信號從細(xì)胞膜往細(xì)胞核中轉(zhuǎn)導(dǎo)，以調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)釋放[12]。本研究中，正向漸進模式遠(yuǎn)隔時適應(yīng)組的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表達(dá)較假手術(shù)組外的其他組顯著提高，提示正向漸進模式能夠通過RISK、SAFE 通路調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)釋放，從而使正向漸進模式組的MPTP 開放程度低于其他組，從而減輕了心肌缺血再灌注。

綜上所述，正向漸進遠(yuǎn)隔時適應(yīng)模式可以發(fā)揮較傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)模式更好的心肌保護作用，其作用機制可能與激活RISK 和SAFE 途徑，抑制MPTP 開放有關(guān)。