沈成龍，陳怡帆，曾英杰，陳煉紅

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

松茸（Tricholoma matsutake），是一種著名的野生食用菌和功能菌，廣泛分布于我國西南地區(qū)[1-2]。近年來，松茸的需求量在不斷增加，但當(dāng)前松茸產(chǎn)品多數(shù)以初加工形式呈現(xiàn)，而深加工的松茸產(chǎn)值是初加工后的3 倍以上，因此深入研究松茸資源具有重大意義[3]。松茸含有多種活性物質(zhì)，而松茸多糖作為松茸中的主要活性物質(zhì)之一，已被證實具有免疫活性、抗微生物、降血糖和抗腫瘤等多種功能[4-8]。

自由基是各種生化反應(yīng)代謝的中間產(chǎn)物，人體中的自由基和抗氧化劑之間的不平衡引發(fā)身體氧化應(yīng)激，會導(dǎo)致細(xì)胞膜功能喪失、酶失活和核酸損傷，最終導(dǎo)致癌癥、心血管疾病、動脈粥樣硬化和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9-10]。已有研究表明多糖可以通過與自由基結(jié)合、抑制自由基生成、阻止脂質(zhì)過氧化物分解和提高內(nèi)抗氧化酶（如SOD、GSH-Px 等）的活性起到抗氧化的作用[11-12]。

目前，國內(nèi)外對松茸多糖抗氧化研究主要集中在體外自由基清除能力、細(xì)胞實驗以及體內(nèi)抗衰老作用方面，Chen 等[13]發(fā)現(xiàn)通過超聲提取分離出的松茸多糖TMP80 具有良好的體外抗氧化活性；吳楊洋等[14]研究發(fā)現(xiàn)了使用不同提取方式提取的松茸多糖抗氧化活性存在差異；Ding 等[15]通過研究松茸多糖的體外自由基清除能力以及細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)松茸多糖具有良好的自由基清除能力并且可以減少過氧化氫對PC12 細(xì)胞的氧化損傷；劉剛等[16]通過動物實驗建立D-半乳糖致衰老模型，發(fā)現(xiàn)松茸多糖可能通過清除體內(nèi)自由基，降低細(xì)胞的過氧化程度發(fā)揮抗衰老的作用。然而，松茸多糖對酒精引起的機體氧化損傷的影響還未見研究。

因此本文以從四川省甘孜州松茸中提取的多糖為材料，以超氧陰離子自由基、ABTS 自由基清除能力和總還原能力為指標(biāo)研究其體外抗氧化能力；通過建立乙醇氧化損傷小鼠模型研究松茸多糖的體內(nèi)抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)松茸提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六周雄性昆明小鼠48 只，體質(zhì)量（30±2）g 購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020-030。本實驗符合動物實驗倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得西南民族大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)；野生松茸（Tricholoma matsutake） 采自四川省甘孜藏族自治州巴塘縣；ABTS（AR） 酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；抗壞血酸（AR）、鐵氰化鉀（AR）、鄰苯三酚（AR） 成都迪康生物技術(shù)有限公司；GPT 試劑盒、GOT 試劑盒、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、過氧化氫（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、SOD 試劑盒、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）試劑盒、總蛋白定量測試盒 南京建成生物工程研究所。

V-1000 型可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；ALPHA 1-4 LSC 冷凍干燥機 德國Martin Christ 公司；TG16-WS 臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；CKX31 倒置顯微鏡 奧林巴斯儀器科技有限公司；ELX800 酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 松茸多糖的提取與純化 準(zhǔn)確稱取一定量干松茸，用粉碎機磨成粉末，過100 目篩，置于盛有80%乙醇的錐形瓶中（料液比為1:20），放入恒溫振蕩器（60 ℃）內(nèi)振蕩4.5 h 后，8000 r/min 離心10 min，收集沉淀烘干后獲得脫脂松茸粉。按1:25 的料液比向脫脂松茸粉中加入蒸餾水，于恒溫水浴（90 ℃）中浸提3 h，靜置后離心，重復(fù)浸提2 次，合并上清液進(jìn)行濃縮，加入4 倍體積95%乙醇4 ℃醇沉過夜，離心并收集沉淀物，再用一定量蒸餾水溶解，向溶液中加入Sevage 試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1（V/V），多糖:Sevage=3:1（V/V）），密封后在搖床中振蕩30 min 后將其倒入分液漏斗中靜置30 min，移除下層有機相，重復(fù)3～5 次，隨后使用截留量為3500 Da的透析袋用流動水對其透析72 h，除去小分子雜質(zhì)，再將15 mL 多糖溶液（50 mg/mL）在4 BV/h 的流速下加載到層析柱中進(jìn)行脫色和進(jìn)一步脫蛋白，用蒸餾水沖洗并收集洗脫液，濃縮、凍干得松茸多糖[6]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.8686x-0.0258（R2=0.9956）計算出其純度為81.25%。

1.2.2 體外抗氧化活性指標(biāo)測定

1.2.2.1 超氧陰離子自由基清除率的測定 向25 ℃的4 mL 0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH=8.2）中加入1.0 mL 鄰苯三酚（6 mmol/L）和1 mL 不同濃度的樣品，再在相同溫度下水浴5 min，最后加入兩滴濃鹽酸以終止反應(yīng)，在320 nm 波長處測定吸光值[17]。

式中：A0為超純水代替樣品時的吸光值，Ax為多糖組吸光值， Ax0為超純水代替鄰苯三酚和鹽酸的吸光值。

1.2.2.2 總還原能力的測定 參考孔沛筠等[18]的方法。依次向1 mL 不同濃度的樣品溶液中添加0.2 mol/mL pH6.6 的PBS 溶液和1.0% K3[Fe（CN）6]溶液各2.5 mL，50 ℃水浴20 min 后立即冷卻，添加10% TCA 2.5 mL，離心取上層清液5 mL，向其中添加4 mL 去離子水及1 mL 0.1%的FeCl3搖勻，靜置10 min 后在700 nm 處測定吸光值。按照以上操作步驟以VC為陽性對照，最后繪制吸光值與溶液濃度間的曲線。

1.2.2.3 ABTS 自由基清除能力的測定 分別向1 mL不同濃度的樣品溶液中加入6 mL 的ABTS 陽離子溶液，25 ℃黑暗條件下反應(yīng)10 min 后于734 nm 處測定吸光值[19]。

式中：A0為用超純水代替樣品時的吸光值；Ai為樣品組吸光值；As為超純水代替ABTS 后的吸光度值。

1.2.3 乙醇氧化損傷模型動物實驗設(shè)計 將小鼠分籠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%的動物房中，晝夜均為12 h，小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水并每日更換墊料，進(jìn)行7 d 的適應(yīng)性喂養(yǎng)。隨后將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的小鼠每組8 只按表1 進(jìn)行分組和灌胃。各劑量組給藥劑量參照《抗氧化功能評價方法》[20]、《保健食品檢驗與評價規(guī)范》[21]等設(shè)定。

表1 實驗小鼠分組及處理Table 1 Grouping and treatment of experimental mice

小鼠連續(xù)灌胃四周后，除空白對照組外，其他各組小鼠一次性灌胃12 mL/kg 的50%乙醇溶液，以建立乙醇氧化損傷小鼠模型。

1.2.4 實驗動物一般情況觀察 每日為小鼠稱重，觀察并記錄六組小鼠在給予50%乙醇后的精神狀態(tài)、行為活動和攝食狀況的變化情況[22]。

1.2.5 體內(nèi)抗氧化活性指標(biāo)測定

1.2.5.1 樣品制備 乙醇灌胃6 h 后稱量小鼠體重并對小鼠進(jìn)行眼眶采血，離心（4 ℃，3000 r/min，15 min）分離出血清，-20 ℃保存?zhèn)溆肹23]；取血后的小鼠頸椎脫臼處死，迅速摘取肝以冰生理鹽水洗凈，用濾紙拭干表面水分后稱重；準(zhǔn)確稱取組織重量，按1:9（g/mL）的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，4 ℃，3000 r/min 離心15 min 取上清液保存待測；隨機取單個小鼠的肝臟組織，多聚甲醛浸泡，石蠟包埋后切片。

1.2.5.2 小鼠肝臟組織切片的制備與觀察 參照彭勇勝[24]的方法進(jìn)行蘇木精-伊紅法（HE 染色法）染色，在光鏡下觀察小鼠的肝組織切片。

1.2.5.3 小鼠血清中ALT、AST、AKP 活力的測定按照試劑盒中的方法測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5.4 小鼠肝臟中SOD、MDA、CAT 和GSH-Px水平的測定 按照試劑盒中的方法測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定結(jié)果均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差“x±s”表示，單因素方差分析利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行，IC50值利用IC50 Calculator 進(jìn)行計算，利用Origin2021 進(jìn)行繪圖，P＜0.05 表示具有顯著差異，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 松茸多糖的體外抗氧化活性結(jié)果分析

圖1 松茸多糖對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.1 The scavenging ability of Tricholoma matsutake polysaccharides on superoxide anion free radicals

2.1.2 松茸多糖的總還原能力 總還原能力是指自由基接收到來自抗氧化物質(zhì)提供的電子后，使自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定物質(zhì)的能力，抗氧化能力隨總還原能力的增強而增強[26]。由圖2 可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，松茸多糖總還原能力隨之上升（P＞0.05），吸光度從0.054 提升至0.163，可以看出其雖然具有一定的總還原能力但較弱，且與VC的總還原能力相差較大。

圖2 松茸多糖的總還原能力Fig.2 The total reducing power of Tricholoma matsutake polysaccharides

2.1.3 松茸多糖對ABTS 自由基清除能力 ABTS 法是使用最廣泛的一種間接檢測抗氧化能力的方法[27]。由圖3 可知，在實驗范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，多糖清除率隨之上升，且當(dāng)多糖濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時，清除率可以達(dá)到96.60%，并且到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，其IC50值為0.25 mg/mL，但VC在其濃度為0.03 mg/mL 時其清除率已到達(dá)100%，VC的IC50為0.0058 mg/mL，由此可見松茸多糖雖具有良好的ABTS 自由基清除能力，但與VC相比還有一定的差距。

圖3 松茸多糖對ABTS 自由基的清除能力Fig.3 The ability of Tricholoma matsutake polysaccharides to scavenge ABTS free radicals

2.2 灌胃期間小鼠體重的變化

從表2 可以看出，各組小鼠在實驗期間的體重均沒有顯著性差異（P＞0.05），說明連續(xù)服用不同劑量的松茸多糖不會對小鼠體重產(chǎn)生明顯影響。

表2 小鼠體重變化Table 2 Changes in body weight of mice

2.3 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠的一般情況觀察

實驗過程中，所有小鼠的行為均正常；第29 d，除空白對照組，其他5 組小鼠均給予50%的乙醇進(jìn)行酒精造模，5 組小鼠起初均表現(xiàn)異常興奮，約30 min 后，小鼠開始站立不穩(wěn)，甚至出現(xiàn)摔倒的現(xiàn)象，漸漸的減少活動，直至停止活動。其中模型組的部分小鼠出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象，松茸多糖低劑量組有個別小鼠出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象，而其他組別中均未有小鼠出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象。12 h 后空白組小鼠飲食，飲水正常，精神狀態(tài)良好，行動靈活；模型組小鼠狀態(tài)普遍較差，食欲、精神狀態(tài)較差且行動遲緩；陽性及松茸多糖各劑量組小鼠精神狀態(tài)雖不及空白組，但與模型組相比均有所改善。這些現(xiàn)象表明松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠有一定的保護(hù)作用。

2.4 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠肝臟組織學(xué)切片觀察結(jié)果

從圖4 可以看出，小鼠肝臟經(jīng)HE 染色后，空白對照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，每個細(xì)胞之間都規(guī)律的排列著，可以看出靜脈形態(tài)正常，無擴張肝血竇；模型對照組小鼠肝組織切片染色增強，且出現(xiàn)了明顯的雙核肝細(xì)胞，肝細(xì)胞的分布較為松散，肝血竇出現(xiàn)嚴(yán)重擴張；而陽性對照組的小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎與正常小鼠相同，肝索排列整齊未出現(xiàn)異常；低劑量組肝細(xì)胞連接松散，肝血竇也出現(xiàn)擴張現(xiàn)象，同時也有雙核肝細(xì)胞的存在；中、高劑量組肝細(xì)胞形態(tài)與對照組相比逐漸恢復(fù)正常，肝血竇縮小，雙細(xì)胞核細(xì)胞數(shù)量降低。說明陽性對照組與高劑量組松茸多糖均對肝損傷有著較強的保護(hù)作用，另外低、中劑量組也對肝損傷有一定的保護(hù)效果且與濃度有關(guān)。

圖4 小鼠肝臟切片（400×）Fig.4 Mouse liver section（400×）

2.5 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠血清中AST、ALT、AKP 活性的影響

由表3 可以看出，與空白對照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST、AKP 含量均有了顯著的升高（P＜0.05）；同時與模型組相比，松茸多糖各劑量組小鼠血清ALT、AST、AKP 含量均表現(xiàn)出下降趨勢，且隨著松茸多糖劑量的增加血清中ALT、AST、AKP含量不斷降低，低、中、高三個劑量組的治療作用均具有顯著性（P＜0.05）。其中松茸多糖高劑量組與模型組相比，血清中ALT、AST、AKP 含量分別降低了28.82%、33.17%、39.72%，其中ALT 與AST 含量的降低效果與VC相當(dāng)（P＞0.05）。

表3 松茸多糖對小鼠血清中ALT、AST、AKP 活力的影響Table 3 Effect of Tricholoma matsutake polysaccharides on the activities of ALT, AST and AKP in the serum of mice

2.6 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠肝臟中SOD、CAT、MDA、GSH-Px 水平的影響

在經(jīng)過50%乙醇灌胃后，各組肝臟指標(biāo)如表4所示。與空白對照組相比，模型組的CAT、SOD、GSH-Px 活力均出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），而MDA 含量出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），表明實驗造模成功。

表4 松茸多糖對小鼠肝臟中CAT、MDA、SOD 和GSH-Px 水平的影響Table 4 Effects of Tricholoma matsutake polysaccharides on the levels of CAT, MDA, SOD and GSH-Px in the liver of mice

在經(jīng)過松茸多糖灌胃后，與模型對照組相比，肝臟中CAT 含量在低、中、高三個劑量組中均顯著增加（P＜0.05），分別增加了27.74%、40.62%、63.07%；肝臟中SOD 含量在中、高兩個劑量組中顯著增加（P＜0.05），其含量分別增加了9.32%和30.69%；肝臟中GSH-Px 僅在高劑量組中出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05），增加了64.31%。同時，CAT 與SOD 與灌胃松茸多糖含量呈現(xiàn)正相關(guān)。

在經(jīng)過低、中、高劑量組灌胃后，小鼠肝臟中的MDA 含量均不同程度的顯著低于（P＜0.05）模型對照組，同時實驗結(jié)果表明小鼠肝臟中的MDA 含量與灌胃松茸多糖的劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

此外，高劑量組中SOD、MDA 與GSH-Px 三項指標(biāo)與陽性對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 松茸多糖的體外抗氧化活性

抗氧化作用是真菌多糖一種重要的生物活性，本實驗通過測定松茸多糖清除、ABTS 自由基的能力以及總還原能力來評價其體外抗氧化能力，結(jié)果表明松茸多糖的體外抗氧化能力較強。其中超氧陰離子自由基清除能力高于李藝萌等[28]使用熱水提取法提取的黑菇多糖以及許女等[29]提取的雞腿菇多糖，與董博斐等[30]提取的紅平菇胞外多糖的超氧陰離子清除率相當(dāng)；松茸多糖的ABTS 自由基清除率與樺褐孔菌多糖組分相比顯示出更優(yōu)異的清除率[31]；同時松茸多糖的總還原能力高于黑木耳多糖的總還原能力[32]。松茸多糖與其他真菌多糖體外抗氧化能力差異可能是由于不同多糖的結(jié)構(gòu)不同造成的。

3.2 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠血清指標(biāo)的影響

乙醇及其衍生物的代謝反應(yīng)會導(dǎo)致肝毒性，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致肝損傷[33]。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶便進(jìn)入血液，血液中ALT 和AST 水平升高[34]。AKP 又叫堿性磷酸酶或者ALP，其水平主要用于診斷肝膽系統(tǒng)疾病，如肝癌、肝硬化等疾病[35]。因此，ALT、AST 和AKP 三者的水平可以反映肝細(xì)胞的受損程度。由此可知在經(jīng)過50%乙醇溶液灌胃后，導(dǎo)致了小鼠肝臟的損傷，使得模型組小鼠血清中的ALT、AST 和AKP 含量顯著升高，表明實驗造模成功。而經(jīng)過灌胃不同劑量的松茸多糖的小鼠，均出現(xiàn)抑制血清中ALT、AST和AKP 含量上升的現(xiàn)象，因此松茸多糖可以在一定程度上減輕乙醇對肝臟的損傷。

3.3 松茸多糖對乙醇氧化損傷小鼠肝臟指標(biāo)的影響

過氧化氫在細(xì)胞內(nèi)的大量存在時會對細(xì)胞造成損傷，過氧化氫酶（CAT）可以將過氧化氫分解成氧和水，降低過氧化氫在細(xì)胞內(nèi)的水平[36]。超氧化物歧化酶（SOD）是一種最有效的內(nèi)源性抗氧化劑，在細(xì)胞內(nèi)可以將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，與許多疾病的發(fā)生緊密相關(guān)[37]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）可以清除由ROS 和自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[38]。本實驗中，在經(jīng)高濃度的乙醇灌胃后，模型組三種酶的活力均受到了不同程度的抑制，進(jìn)一步驗證了實驗造模成功，而通過松茸多糖的處理組別，這三種酶的活力均得到了一定的恢復(fù)，表明松茸多糖可以通過提高機體的內(nèi)源抗氧化酶活性提高機體的抗氧化能力。

過多的活性氧（ROS）會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，這一破壞過程的最終產(chǎn)物之一是丙二醛（MDA），因此MDA 的含量可以反映機體脂質(zhì)過氧化和組織過氧化損傷程度[39-40]。在本實驗中，松茸多糖組MDA 含量相較于模型組出現(xiàn)顯著降低，表明松茸多糖可以降低機體內(nèi)脂質(zhì)和組織過氧化的程度，進(jìn)而減少MDA 的含量。同時肝臟切片結(jié)果顯示松茸多糖可以減輕由乙醇引發(fā)的肝損傷。

綜上，實驗結(jié)果表明，松茸多糖可以通過恢復(fù)肝臟中氧化酶活力，降低MDA 的含量從而表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

4 結(jié)論

在體外抗氧化實驗中，松茸多糖表現(xiàn)出一定的體外抗氧化能力，當(dāng)濃度為1 mg/mL 時，其對和ABTS+·的清除率分別為56.67%和96.60%，其總還原能力的吸光值為0.163；動物實驗結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃四周后，與模型對照組相比，松茸多糖可以使小鼠血清中的ALT、AST 和AKP 活力顯著降低（P＜0.05），使肝臟中CAT、SOD 和GSH-Px 的水平顯著升高（P＜0.05），MDA 的含量顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。綜上，松茸多糖表現(xiàn)出良好的體內(nèi)外抗氧化能力。