劉洋帆，王 迪，李春生，相 歡，陳勝軍，楊賢慶，李來好，鄧建朝,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

鰹魚（Katsuwonus pelamis）屬于鯖科鰹屬，主要分布在太平洋、印度洋、大西洋熱帶和亞熱帶海域，其營養(yǎng)價(jià)值豐富，常用來做成生魚片、罐頭、木魚花等食品，暢銷日本、歐洲等地[1]。鰹魚肉質(zhì)蛋白含量高，脂肪含量低，富含多不飽和脂肪酸，方便人體吸收和利用[2]。然而鰹魚在運(yùn)輸、加工和貯藏過程中極易受到微生物的影響，引起腐敗變質(zhì)與生物胺的積累，使鰹魚營養(yǎng)價(jià)值降低并影響其質(zhì)量安全[3]。

鰹魚腐敗變質(zhì)是一系列復(fù)雜的過程，其中微生物是引起魚肉腐敗變質(zhì)的主要原因之一，部分微生物在水產(chǎn)品中生長占優(yōu)勢并可加速水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)進(jìn)程，這類微生物稱為優(yōu)勢腐敗菌[4]。優(yōu)勢腐敗菌可以產(chǎn)生大量的腐敗代謝產(chǎn)物，還可分解脂肪和蛋白質(zhì)并產(chǎn)生難聞異味加速水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，其腐敗活性較其他微生物強(qiáng)[5]。魚類及魚類制品中富含豐富的蛋白質(zhì)，微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶可將魚肉中游離的氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺[6]。生物胺是一類含氮化合物，常存在于動植物體和食品中，同時(shí)生物胺具有穩(wěn)定性，普通加熱及冷凍等加工方式無法破壞分解[7]。據(jù)研究表明，人體攝入過量生物胺會引發(fā)嘔吐、頭疼、蕁麻疹等過敏性中毒反應(yīng)[8]，國內(nèi)外常有因攝入過量生物胺而導(dǎo)致中毒的案例，其中組胺的毒性最大，因此我國在GB 2733-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動物性水產(chǎn)品》[9]中規(guī)定青皮紅肉海水魚的組胺含量不得超過400 mg/kg，而其他海水魚類則不超過200 mg/kg。Jskelinen 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在冷藏鮭魚中的優(yōu)勢腐敗菌是發(fā)光桿菌屬，假單胞菌屬是黃鰭金槍魚的優(yōu)勢腐敗菌。Lakshmanan 等[11]研究了冷藏魚蝦中產(chǎn)胺菌的生成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬和假單胞菌屬是魚蝦的主要產(chǎn)胺菌。Kuley 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸桿菌不僅可使魚腐敗變質(zhì)還可產(chǎn)生生物胺。魚肉中由于腐敗菌和產(chǎn)胺菌的存在，不僅會降低魚本身營養(yǎng)價(jià)值還會對消費(fèi)者身體健康造成危害。

針對以上問題，本研究篩選并探究鰹魚中的優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌，實(shí)驗(yàn)采用普通平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基與改良的Niven’s 生物胺篩選培養(yǎng)基對低溫貯藏的鰹魚進(jìn)行優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的篩選，并利用16S rDNA 分子技術(shù)對菌株進(jìn)行鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將分離得到的3 株優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌接回?zé)o菌魚肉中并在4 ℃下貯藏，對比實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)、TVB-N 值和生物胺含量，同時(shí)對腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU進(jìn)行計(jì)算，比較3 株菌的致腐產(chǎn)胺能力。本研究通過比較鰹魚中優(yōu)勢菌株的致腐產(chǎn)胺能力，為把控鰹魚貯藏加工流通過程中的品質(zhì)保證提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚 廣州市灃洋食品有限公司，4 ℃低溫冷藏條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；水浸鰹魚罐頭 日本Hagoromo公司，水浸鰹魚罐頭在加工過程中經(jīng)過高溫滅菌處理，為無菌狀態(tài)；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（plate count agar, PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（trypticase soy agar, TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PCR 產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒 上海碩美生物科技有限公司；瓊脂糖 廈門太陽馬生物工程有限公司；乙腈、甲酸、二氯甲烷 麥克林生化科技公司；0.22 μm 一次性針頭過濾器 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；7 種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品（組胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、苯乙胺和1，7-二氨基庚烷，純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich 公司；改良的Niven’s 生物胺篩選培養(yǎng)基（1 L）：準(zhǔn)確稱取5 g 蛋白胨、5 g 酵母粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)各0.2%游離氨基酸（L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-苯丙氨酸和賴氨酸）、20 g 瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；5 g 氯化鈉、1 g 碳酸鈣 麥克林生化科技公司；0.06 g 溴甲酚紫 上海源葉生物科技有限公司；使用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至5.1，121 ℃高壓滅菌15 min。

SQ510C 立式壓力蒸汽滅菌器 日本Yamato公司；SPX 智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；IN612C 低溫培養(yǎng)箱 日本Yamato 公司；CEBO-24高通量組織研磨儀 上海測博生物有限公司；TDZ5-WS 離心機(jī) 長沙湘儀儀器有限公司；DYY-8C 電泳儀 北京六一儀器廠；9700 PCR 儀、3730XL 測序儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；TQ-S Micro 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters 公司；Milli-Q 純水系統(tǒng) 美國Millipore 公司；KjeltecTM2300 全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯集團(tuán)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鰹魚優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的篩選 稱取25 g 冷藏鰹魚肉，加入225 mL 無菌生理鹽水，拍打混合均勻后取1 mL 液體，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，吸取1 mL 稀釋液涂布于PCA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取不同單菌落，分離純化2～3 代，將菌株接種在Niven’s 生物胺篩選培養(yǎng)基上，選取顏色變化明顯的菌株，分離純化2～3 代，25 ℃培養(yǎng)24 h后放于4 ℃冰箱備用[13]。

1.2.2 菌株的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 提取基因組DNA 對細(xì)菌進(jìn)行16S 擴(kuò)增，以27F（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1492（5′-TACGGCTACC TTGTTACGACTT-3′）作為引物進(jìn)行擴(kuò)增目的基因，PCR 擴(kuò)增：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃持續(xù)變性20 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀，最后將純化后PCR 產(chǎn)物測序，測序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST 比對，選取數(shù)株同源性較高的菌株，使用MEGA 5 軟件構(gòu)建鰹魚優(yōu)勢腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌致腐能力的分析

1.2.3.1 菌懸液的制備與菌株的接種 從純化后的平板上挑取菌落接到TSB 中，25 ℃培養(yǎng)18～20 h。將電子秤、無菌稱量皿和稱量勺等工具放于超凈臺中紫外滅菌30 min 以上，在無菌操作臺中稱取100 g鰹魚肉放于無菌袋中，分別接熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌魚肉中，在無菌操作臺中封好無菌袋4 ℃下貯藏，空白實(shí)驗(yàn)組是未接種菌株的無菌魚肉，每天進(jìn)行取樣測定實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)、TVB-N 值和生物胺含量。

1.2.3.2 腐敗菌生長情況的測定 稱取5 g 魚肉于45 mL 生理鹽水中，拍打混合均勻后吸取100 μL 均質(zhì)樣液，使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液進(jìn)行逐級稀釋，稀釋后的菌液涂布于TSA 上，25 ℃培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)。

1.2.3.3 TVB-N 的測定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[14]，使用凱氏定氮法對樣品進(jìn)行TVB-N 值測定。

1.2.3.4 腐敗菌腐敗能力的分析 參照許振偉等[15]的方法中腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU的計(jì)算公式：

式中：（TVB-N）0、（TVB-N）i—初始點(diǎn)、貯藏期終點(diǎn)的TVB-N 值（mg N/100 g）；N0、Ni—初始點(diǎn)、貯藏期終點(diǎn)的菌落數(shù)（CFU/g）。

1.2.4 優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力的分析 稱取2 g魚肉于50 mL 離心管中并放入2 顆鋼球，加入5 mL 0.2%酸化乙腈和100 μL 內(nèi)標(biāo)液（1，7-二氨基庚烷）混合均勻，研磨10 min 后，以4000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，重復(fù)以上操作，收集上清液定容至10 mL 后進(jìn)行氮吹，加入1 mL 復(fù)溶液和3 mL 二氯甲烷，渦旋1 min 后以10000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過0.22 μm 的濾膜，用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測生物胺，并使用1，7-二氨基庚烷作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算生物胺含量[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 11 軟件（MEGA 有限公司）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)處理結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS Statistics 25 軟件，采用Microsoft Office Excel 2019 軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA 分析結(jié)果

從PCA 和Niven’s 生物胺篩選培養(yǎng)基中挑取顏色變化較為明顯的單菌落，隨機(jī)分離篩選出8 株菌，將篩選出的菌株分別編號為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7 和T8，對這8 株菌進(jìn)行16S 全長序列PCR擴(kuò)增，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳圖譜見圖1。由圖可知，擴(kuò)增后的8 株菌在1000 和2000 bp 之間出現(xiàn)清晰的熒光條帶，并且無拖尾現(xiàn)象，可用于后續(xù)測序使用。

圖1 8 種菌株的16S rDNA 電泳圖譜Fig.1 16S rDNA electrophoresis map of 8 strains

2.2 菌株的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

考慮到優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌在冷藏鰹魚中仍會生長繁殖，因此預(yù)實(shí)驗(yàn)把8 株菌放于4 ℃培養(yǎng)箱中觀察其生長變化，最后發(fā)現(xiàn)有3 株菌具有嗜冷性，這3 株菌的編號分別為T4、T6 和T7，將3 株菌擴(kuò)增后的16S rDNA 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，將3 株菌的測序結(jié)果用MEGA 11 軟件構(gòu)建成系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2 所示，發(fā)育樹顯示T4 屬于假單胞菌屬，且與熒光假單胞菌親源關(guān)系最近相似性為100%，T6 屬于檸檬酸桿菌屬且弗式檸檬酸桿菌相似性達(dá)99%，T7 屬于氣單胞菌屬與嗜水氣單胞菌親源關(guān)系最近，其相似性為99%。假單胞菌是食品中常見的嗜冷性致腐菌，Xie 等[17]研究了熒光假單胞菌對鮭魚的致腐能力分析，研究表明熒光假單胞菌會導(dǎo)致鮭魚中腐敗產(chǎn)物累積。弗式檸檬酸桿菌也被證實(shí)是一種致病致腐的有害微生物[18]，聶芳紅等[19]發(fā)現(xiàn)凍羅非魚片大腸菌群主要為弗氏檸檬酸桿菌。嗜水氣單胞菌是一種食源性病原體，經(jīng)研究證實(shí)嗜水氣單胞菌會對人類健康造成危害[20]，Bo 等[21]研究發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品中致腐和致病性革蘭氏陰性菌主要有嗜水氣單胞菌、鮑曼不動桿菌、假單胞菌和腸桿菌等26 種菌。據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可看出實(shí)驗(yàn)最終篩選出來的3 株菌分別是熒光假單胞菌、弗式檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌，這3 株菌均為革蘭氏陰性菌，能夠在低溫下可繼續(xù)生長，是水產(chǎn)品常見的腐敗菌。

圖2 3 種菌株16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences from 3 strains

2.3 鰹魚優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌致腐能力的分析

2.3.1 菌落總數(shù)變化分析 微生物生長繁殖是引起鰹魚腐敗變質(zhì)的主要原因，使用優(yōu)勢腐敗菌在魚肉中的生長情況可作為衡量菌株致腐能力的指標(biāo)之一。3 組接種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的菌落總數(shù)變化如圖3 所示，接種熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌的初始菌落總數(shù)分別為5.73、5.58 lg CFU/g和5.75 lg CFU/g，由于空白對照組是未接入任何菌的無菌魚肉，其菌落總數(shù)值為0。在4 ℃貯藏期間，優(yōu)勢腐敗菌利用魚肉中的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，隨著氧氣和營養(yǎng)成分的消耗，會造成腐敗代謝產(chǎn)物的累積。從圖中可看出，隨著貯藏時(shí)間的增加，3 組接種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的菌落總數(shù)值也逐漸增加，說明這3 株菌在4 ℃的貯藏條件下在魚肉中仍可生長并對其造成影響。在貯藏前5 d 中，接種嗜水氣單胞菌組的生長情況比接種熒光假單胞菌組和弗式檸檬酸桿菌組生長較快，在貯藏期后期3 組菌的菌落總數(shù)值相差不大。在第8 d 貯藏結(jié)束時(shí)，接種熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌組的菌落總數(shù)分別增長到8.36、8.27 和8.13 lg CFU/g，結(jié)果表明3 株優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌在冷藏鰹魚中的生長狀況良好。

圖3 鰹魚接種3 種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的菌落總數(shù)變化Fig.3 Changes in colony counts of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

2.3.2 TVB-N 值的變化分析 TVB-N 是評價(jià)水產(chǎn)品新鮮程度的一個(gè)重要指標(biāo)，在水產(chǎn)品貯藏期間，其體內(nèi)蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)在微生物和酶的作用下，分解成胺和氨類等鹽基氮類物質(zhì)，TVB-N 值越高，代表魚肉中蛋白質(zhì)降解程度越嚴(yán)重[22]。由圖4 可知，接種3 組優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的TVB-N 值在鰹魚貯藏期間逐漸增加，在貯藏初期，接種熒光加單胞菌組、弗式檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組的TVB-N 值分別為6.71、6.22 和6.67 mg/100 g?？瞻讓φ战M的TVB-N值也隨著貯藏時(shí)間的增加，有小幅度的增長，可能是魚肉在無菌袋中進(jìn)行了氧化分解，但和另外3 組實(shí)驗(yàn)組相比值很低。從圖中看出，接種嗜水氣單胞菌組的TVB-N 值在3 組樣品中增長最快，這可能是因?yàn)樵谫A藏前期嗜水氣單胞菌的菌落總數(shù)增長較快，使得其TVB-N 值也相對較高。GB/T 18108-2019《鮮海水魚通則》[23]中規(guī)定海產(chǎn)品中的TVB-N 值≤30 mg/100 g，接種弗式檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組在貯藏結(jié)束時(shí)TVB-N 值分別達(dá)到了30.30 和31.29 mg/100 g，2 組TVB-N 值均超過了國標(biāo)限量，接種熒光假單胞菌組TVB-N 值最終達(dá)到28.21 mg/100 g，結(jié)果表明嗜水氣單胞菌在鰹魚中TVB-N 的產(chǎn)量大于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌。Wang 等[24]在嗜水氣單胞菌、杰氏假單胞菌和腐敗希瓦氏菌對無菌草魚片的致腐能力研究中發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的TVB-N 值最高。嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)品中常見的人-獸-魚共患的致病菌，對水產(chǎn)業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[25]，由實(shí)驗(yàn)研究可得出，嗜水氣單胞菌對鰹魚還具有一定的致腐性，可以加快魚肉的腐敗變質(zhì)過程。

圖4 鰹魚接種3 種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的TVB-N 值變化Fig.4 Changes in TVB-N values of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

2.3.3 腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子的分析 腐敗代謝物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU即貨架期終點(diǎn)時(shí)單位數(shù)量腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物量[26]，不同的腐敗菌生長和代謝情況不同，結(jié)合菌落總數(shù)和TVB-N 值計(jì)算出YTVB-N/CFU可對優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力進(jìn)行綜合比較。許多研究者使用YTVB-N/CFU值來比較腐敗菌的致腐能力，于淑池等[27]比較冷藏卵形鯧鲹優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力，Xie 等[17]比較熒光假單胞菌在不同溫度下對鮭魚致腐能力的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)以YTVB-N/CFU為鰹魚中優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的致腐能力評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如表1 所示。接種3 組優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌中嗜水氣單胞菌組的YTVB-N/CFU是最高，為1.48×10-7mg/CFU，其次是弗氏檸檬酸桿菌組和熒光假單胞菌組，YTVB-N/CFU值 分 別 為1.20×10-7mg/CFU 和8.39×10-8mg/CFU，嗜水氣單胞菌組YTVB-N/CFU值是熒光假單胞菌組的1.76 倍，是弗式檸檬酸桿菌組的1.23 倍，由表中計(jì)算結(jié)果可得優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌對鰹魚的致腐能力為嗜水氣單胞菌＞弗氏檸檬酸桿菌＞熒光假單胞菌。

表1 鰹魚接種3 種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌致腐因子的比較Table 1 Comparison of yield factors in skipjack tuna inoculated with 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria

2.4 鰹魚優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力的分析

鰹魚含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，適合優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌快速生長繁殖，在產(chǎn)胺菌和氨基酸脫羧酶的共同作用下造成生物胺積累[28]，魚肉中游離的組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸會脫羧形成組胺、尸胺和腐胺，通?？梢杂蒙锇泛縼砗饬眶~類產(chǎn)品的質(zhì)量安全及其腐敗程度[29]。本實(shí)驗(yàn)使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測實(shí)驗(yàn)組生物胺的含量，結(jié)果如表2 所示。由表可知，3 組接菌樣品的組胺、尸胺和腐胺含量隨著貯藏時(shí)間顯著增加（P＜0.05），接種嗜水氣單胞菌的組胺含量上升最快，在貯藏結(jié)束時(shí)，組胺含量達(dá)到261.22 mg/kg，其次是熒光假單胞菌組，貯藏結(jié)束時(shí)其組胺含量為196.23 mg/kg。貯藏結(jié)束時(shí)，接種熒光假單胞菌組、弗氏檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組的尸胺含量分別為65.35、55.49 和69.99 mg/kg，腐胺的含量也分別達(dá)到57.22、55.39 和54.81 mg/kg。將4 組樣品的總生物胺含量進(jìn)行匯總，結(jié)果如圖5所示，由圖中可明顯看出接種嗜水氣單胞菌組的總生物胺含量最高，其次是熒光假單胞菌組，最后是弗式檸檬酸桿菌組，由于酪胺和苯乙胺的含量相對較少，在圖中無法明顯看出。由生物胺檢測結(jié)果綜合比較來看，在鰹魚中嗜水氣單胞菌的產(chǎn)胺能力強(qiáng)于熒光假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌。組胺是紅肉魚中常見的生物胺，并且影響魚肉質(zhì)量與安全，Kim 等[30]研究發(fā)現(xiàn)從太平洋鯖魚中分離出的假單胞菌、發(fā)光菌、氣單胞菌3 種產(chǎn)胺菌均能在冷藏溫度生長并生成組胺，說明許多產(chǎn)胺菌在低溫條件下仍能生長。尸胺和腐胺常見于腐敗水產(chǎn)品中，雖然毒性較組胺低，但也會對人體造成一系列不良反應(yīng)并且同時(shí)可增強(qiáng)組胺的毒性，尸胺與腐胺與魚肉腐敗密切相關(guān)，通常情況下魚肉腐敗程度越高其生物胺的含量越高，說明優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的致腐能力和產(chǎn)胺能力可能也存在相關(guān)性。

表2 鰹魚接種3 種優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的生物胺含量Table 2 Biogenic amines content of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

圖5 貯藏第8 天4 組樣品的總生物胺含量Fig.5 Total biogenic amine content of the four groups of samples on the 8th day storage

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用PCA 和Niven’s 生物胺篩選培養(yǎng)基篩選鰹魚中優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌，研究篩選到8 株菌，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)最終挑選出3 株優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌，通過16S rDNA 鑒定結(jié)果顯示3 株菌分別是熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌。將3 株菌接種到無菌鰹魚罐頭中，分析比較4 ℃下優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌對鰹魚的致腐能力和產(chǎn)胺能力。通過測定菌落總數(shù)、TVB-N 值和計(jì)算比較YTVB-N/CFU得出，嗜水氣單胞菌對鰹魚的致腐能力強(qiáng)于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌，通過檢測不同接菌樣品的生物胺含量顯示嗜水氣單胞菌在鰹魚中產(chǎn)胺能力最強(qiáng)，綜合分析比較可得，嗜水氣單胞菌對鰹魚的致腐產(chǎn)胺能力大于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌。本研究進(jìn)一步了解鰹魚中優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌，并分析比較出對鰹魚品質(zhì)影響最大的是嗜水氣單胞菌，為比較鰹魚中優(yōu)勢腐敗產(chǎn)胺菌的致腐產(chǎn)胺能力提供數(shù)據(jù)理論依據(jù)。