陳彬萱，馬麗莎，周仁芳

自身免疫病(autoimmune diseases，AID)泛指機(jī)體免疫效應(yīng)細(xì)胞或效應(yīng)分子針對(duì)自身組織或細(xì)胞產(chǎn)生病理性免疫應(yīng)答反應(yīng)，由自身免疫反應(yīng)參與發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致組織損傷或功能障礙的疾病。AID根據(jù)臨床表現(xiàn)、病變累及的范圍，通常分為器官特異性AID和系統(tǒng)性AID。在世界范圍內(nèi)，7%～10%的人群受AID困擾，尤以女性多見[1]。AID的臨床表現(xiàn)具有廣泛性、復(fù)雜性，幾乎可涉及到各臨床專科，臨床醫(yī)生往往難以明確診斷。對(duì)此，臨床需要大量的生物標(biāo)志物，而自身抗體作為AID最具有特異性的生物標(biāo)志物，且多數(shù)AID伴有特征性的自身抗體譜，通過檢測(cè)自身抗體可為自身免疫病診療提供重要依據(jù)。 抗核抗體(antinuclear antibodies，ANA)作為AID患者最常見的一類自身抗體，主要見于系統(tǒng)性AID，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome，SS)、系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)、特發(fā)性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIM)及混合結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)等，也可見于器官特異性AID、感染性疾病、腫瘤及健康人群中。ANA及其特異性自身抗體的臨床檢測(cè)，對(duì)相關(guān)疾病的分類、鑒別、分型、預(yù)測(cè)、預(yù)后及預(yù)防等具有重要的臨床意義[2]。在歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟/美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(EULAR/ACR)發(fā)布的2019年SLE分類標(biāo)準(zhǔn)中，ANA作為分類標(biāo)準(zhǔn)的前提條件[3]。

目前，以人喉癌上皮細(xì)胞(HEp- 2)作為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)是檢測(cè)ANA最為常見的方法，可觀察到各種特征性的熒光模式，其中核斑點(diǎn)型、核均質(zhì)型、核仁型等常見熒光模型ANA的相關(guān)臨床意義已被廣泛接受和深入研究。而近年不斷被重視的致密細(xì)斑點(diǎn)型(dense fine speckled，DFS)ANA，于1994年首先在間質(zhì)性膀胱炎患者中發(fā)現(xiàn)此特征性的ANA熒光模型[4]。其相應(yīng)靶抗原，最初根據(jù)熒光模型和免疫印跡法出現(xiàn)分子量為70×103g/mol的復(fù)合物，而被命名為DFS70。隨后鑒定為晶狀體上皮細(xì)胞衍生生長因子(lens epithelium derived growth factor，LEDGF)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄共激活因子p75等[5- 6]。致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其相應(yīng)的特異性自身抗體(抗DFS70抗體)可見于多種疾病患者，如功能性、代謝性、慢性炎癥性、腫瘤、AID等患者，以及健康人群[6-11]。迄今為止尚未證實(shí)致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA、抗DFS70抗體與疾病特定的臨床相關(guān)性，但已有國外臨床研究表明，抗DFS70抗體單獨(dú)陽性有助于ANA相關(guān)AID的排除。本文就致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及抗DFS70抗體的靶抗原特征、臨床檢測(cè)及臨床意義進(jìn)行綜述，為AID診療提供新思路。

1 靶抗原生物學(xué)特性

1.1 靶抗原鑒定

根據(jù)以HEp- 2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的IIF檢測(cè)ANA呈現(xiàn)的致密細(xì)斑點(diǎn)型熒光模型(DFS)，結(jié)合靶抗原在免疫印跡法中呈現(xiàn)分子量約為 70×103g/mol的復(fù)合物，靶抗原被稱為DFS70。后來被鑒定為晶狀體上皮細(xì)胞衍生生長因子75×103g/mol(LEDGF/p75)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄共激活因子p75(TCP75)，以及轉(zhuǎn)錄共激活因子PC4和SFRS的相互作用蛋白(PSIP1)[6]。DFS70廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞和組織中，通過免疫電鏡發(fā)現(xiàn)靶抗原定位于細(xì)胞分裂間期染色質(zhì)，集中于濃縮染色質(zhì)區(qū)域和核仁周圍染色質(zhì)(不包括核仁區(qū))，以及細(xì)胞分裂中期、后期的濃縮染色質(zhì)區(qū)域[12]。

1.2 靶抗原結(jié)構(gòu)

DFS70靶抗原的氨基端(N端)存在約93個(gè)氨基酸組成的PWWP(脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸)結(jié)構(gòu)域，具有肝癌衍生生長因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)蛋白家族的共同特征。PWWP由β折疊區(qū)域和螺旋區(qū)域組成，可結(jié)合修飾的核小體中的組蛋白賴氨酸殘基，也可以通過其帶正電荷(陽離子)的表面區(qū)域與DNA結(jié)合[13-15]。PWWP區(qū)域后面包括3個(gè)電荷區(qū)域(CR1、CR2、CR3)、核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)、AT-hook DNA結(jié)合基序的串聯(lián)拷貝(ATH)區(qū)域，上述結(jié)構(gòu)域?qū)θ旧|(zhì)活性位點(diǎn)的識(shí)別至關(guān)重要[16-17]。靶抗原的羧基端(C端)包含一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，為HIV整合酶結(jié)合區(qū)域(integrase binding domain，IBD)，可促進(jìn)HIV DNA整合到轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)中。IBD為靶抗原主要的免疫原性區(qū)域，是結(jié)合抗DFS70抗體的抗原表位。

1.3 靶抗原功能

DFS70靶抗原的N端主要與DNA結(jié)合，C端作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，具有保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激的潛在作用，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、炎癥通路及腫瘤的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要的作用[18- 21]。DFS70靶抗原產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答的確切機(jī)制仍未明確，但研究發(fā)現(xiàn)DFS70在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的片段(主要是IBD區(qū)域)，可能在炎癥條件下促發(fā)機(jī)體的自身免疫反應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體[18]。IBD參與HIV與宿主染色質(zhì)的整合和復(fù)制[21]，通過對(duì)敲除DFS70表達(dá)的缺失細(xì)胞研究，證明了DFS70在HIV整合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，特別是IBD區(qū)域。通過RNA干擾(siRNA)技術(shù)，短暫和穩(wěn)定的IBD抑制作用導(dǎo)致HIV載量的顯著減少[22- 23]。DFS70在前列腺、結(jié)腸、乳腺、甲狀腺等腫瘤患者中的表達(dá)明顯增加[18]，如前列腺癌中DFS70的異位過度表達(dá)與特異性應(yīng)激、抗氧化蛋白的上調(diào)及抵抗非凋亡細(xì)胞死亡等有關(guān)[24- 26]。DFS70也可促進(jìn)腫瘤形成，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、血管生長、DNA修復(fù)及化療耐藥性等[27- 29]。另外，研究表明DFS70在正常細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，可能通過組蛋白修飾來維持特定細(xì)胞中的染色質(zhì)處在正常轉(zhuǎn)錄狀態(tài)[30]。

上述DFS70靶抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能，對(duì)致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA、抗DFS70抗體的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)、選擇及臨床意義具有一定的相關(guān)性(圖1)[31]。

圖1 DFS70/p52靶抗原的結(jié)構(gòu)域和功能[31]

2 致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)臨床檢測(cè)

2.1 間接免疫熒光法(IIF)檢測(cè)致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA

目前，對(duì)于ANA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，主要采用以HEp- 2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的間接免疫熒光法(IIF)。由于此檢測(cè)技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被國內(nèi)外的專業(yè)學(xué)會(huì)推薦為ANA檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”、“參考方法”、“首選方法”[32- 35]。ANA-IIF熒光模型作為ANA檢測(cè)結(jié)果的重要參數(shù)，通常根據(jù)靶抗原在實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中的分布，呈現(xiàn)形態(tài)各異的熒光模型。其特征性的熒光模型與ANA特異性自身抗體存在一定的相關(guān)性，熒光模型結(jié)果對(duì)進(jìn)行下一步特異性抗體的檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義，且與AID具有一定的臨床相關(guān)性。

ANA常見的熒光模式(核斑點(diǎn)型、核均質(zhì)型、核仁型等)已被廣泛接受和研究，而近年國外研究報(bào)道的致密細(xì)斑點(diǎn)型(DFS)，已被ANA熒光模型國際共識(shí)(international consensus on antinuclear antibody pattern，ICAP)、國內(nèi)ANA檢測(cè)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)列入必報(bào)的熒光模型[35- 36]。在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)典型的DFS熒光模型為[37]：(1)HEp- 2細(xì)胞：分裂間期HEp- 2細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻一致的致密細(xì)斑點(diǎn)型的熒光染色，核仁區(qū)熒光染色與核漿類似或陰性；分裂期細(xì)胞濃縮的染色體區(qū)也呈現(xiàn)均勻一致的致密細(xì)斑點(diǎn)型熒光染色，染色體區(qū)域外熒光染色陰性。(2)肝組織冰凍切片：肝細(xì)胞核常呈現(xiàn)熒光染色陰性或細(xì)顆粒型熒光染色模型，熒光強(qiáng)度弱于HEp- 2細(xì)胞(圖2a，b)。與ANA-IIF常見的細(xì)胞核均質(zhì)型熒光模型鑒別要點(diǎn)：細(xì)胞核均質(zhì)型在分裂間期HEp- 2細(xì)胞呈均質(zhì)型或均質(zhì)周邊型熒光染色模型，肝組織冰凍切片中肝細(xì)胞核常呈現(xiàn)均質(zhì)型熒光染色模型，熒光強(qiáng)度與HEp- 2細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本一致；與ANA-IIF常見的典型的細(xì)胞核斑點(diǎn)型熒光模型鑒別要點(diǎn)：典型的細(xì)胞核斑點(diǎn)型在分裂期HEp- 2細(xì)胞的濃縮染色體熒光染色陰性(圖2c，d)。

圖2 致密細(xì)斑點(diǎn)型、核均質(zhì)型、核斑點(diǎn)型免疫熒光染色圖(×400)

對(duì)于DFS的正確判讀，在一項(xiàng)國際調(diào)查中，參與者對(duì)經(jīng)典的ANA熒光模型識(shí)別的準(zhǔn)確率較高(74.4%～95.2%)，而對(duì)單獨(dú)的DFS識(shí)別的準(zhǔn)確率明顯偏低(約50%)，對(duì)于ANA混合型中的DFS識(shí)別的準(zhǔn)確率不到10%[38]。因此，在臨床實(shí)踐中如何正確判讀DFS 仍是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，開展其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)的臨床檢測(cè)顯得尤為重要。

2.2 免疫學(xué)方法檢測(cè)抗DFS70抗體

抗DFS70抗體的檢測(cè)包括多種免疫學(xué)方法[39- 43]，如改良的IIF、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)免疫印跡法(DIA)、線性免疫印跡法(LIA)、化學(xué)發(fā)光法(CLIA)等。在改良IIF中，可使用靶抗原(DFS70)與待檢測(cè)血清標(biāo)本進(jìn)行免疫吸附，根據(jù)吸附前后HEp- 2細(xì)胞上呈現(xiàn)DFS熒光模型的變化，判斷抗DFS70抗體的存在與否[40- 41]。另一種改良IIF對(duì)HEp- 2細(xì)胞中表達(dá)DFS70的基因進(jìn)行敲除，通過野生型、基因敲除的HEp- 2細(xì)胞(1∶9混合)作為IIF檢測(cè)ANA的實(shí)驗(yàn)室基質(zhì)，通過不同細(xì)胞呈現(xiàn)的DFS差別，以判斷抗DFS70抗體。對(duì)于上述兩種改良IIF檢測(cè)抗DFS70抗體，由于采用不同的實(shí)驗(yàn)基質(zhì)、檢測(cè)方法及針對(duì)不同的抗原表位等，檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較低(kappa=0.22)[44]。另外，根據(jù)DFS70靶抗原的不同氨基酸序列設(shè)計(jì)的ELISA、LIA、CLIA等，臨床研究顯示具有不同的臨床診斷效能、方法學(xué)特點(diǎn)[45]。如ELISA具有高敏感性、定量，但適合于集中批量檢測(cè)的特點(diǎn)。LIA具有高敏感性、易操作、自動(dòng)化及隨機(jī)組合的特點(diǎn)，但其檢測(cè)結(jié)果為半定量。CLIA具有高敏感性、高特異性、定量及自動(dòng)化的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于自身抗體的臨床檢測(cè)。因此，篩選出針對(duì)特異性抗原表位、高敏感性、高特異性、簡單快速及易自動(dòng)化的抗DFS70抗體檢測(cè)方法，具有重要的臨床意義。

2.3 致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)檢測(cè)策略

在ANA檢測(cè)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)中，建議在ANA的臨床檢測(cè)策略中可先用IIF進(jìn)行ANA檢測(cè)，若結(jié)果為陽性，需進(jìn)一步進(jìn)行ANA針對(duì)靶抗原的特異性自身抗體檢測(cè)，為疾病確診提供依據(jù)[35]。同樣，對(duì)于致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)的檢測(cè)策略，可先用IIF進(jìn)行DFS的檢測(cè)，陽性后進(jìn)一步采用各種免疫學(xué)方法進(jìn)行抗DFS70抗體的檢測(cè)。但由于DFS的正確判讀仍存在諸多困難，另外其他特異性自身抗體也會(huì)呈現(xiàn)DFS的熒光模型。因此，對(duì)于采用臨床專家共識(shí)中的檢測(cè)策略，或IIF檢測(cè)DFS聯(lián)合各種免疫學(xué)方法檢測(cè)抗DFS70抗體的策略，仍存在爭議，需要進(jìn)行深入的臨床研究[46- 47]。

3 致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)的臨床意義

致密細(xì)斑點(diǎn)型ANA及其特異性自身抗體(抗DFS70抗體)最初發(fā)現(xiàn)于間質(zhì)性膀胱炎[4]，隨后報(bào)道見于炎癥性疾病、惡性腫瘤、自身免疫病及健康人群等[48]。

課題組在前期的臨床研究中，對(duì)臨床就診患者中的DFS陽性檢出率，以及DFS陽性的AID患者中的相關(guān)臨床信息和實(shí)驗(yàn)室特征進(jìn)行分析[37]。發(fā)現(xiàn)DFS在ANA常規(guī)檢測(cè)標(biāo)本中的陽性率為1.81%，在ANA陽性者中的陽性率為8.79%。男、女性別者在不同年齡組間的DFS陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，以≥50歲組的DFS陽性率為最高。ANA陽性檢出率以風(fēng)濕免疫科就診患者為最高，但DFS陽性主要見于感染科、皮膚科、神經(jīng)科、腎內(nèi)科等就診患者。DFS陽性者包括AID患者(16.53%)和非AID患者(83.47%)。其中系統(tǒng)性AID中以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者構(gòu)成比最高(29.27%)，器官特異性AID中以自身免疫性甲狀腺炎患者構(gòu)成比最高(31.71%)。DFS陽性滴度1∶100在非AID患者中的陽性率高于AID者(P<0.05)，DFS陽性滴度1∶320則在AID患者中的陽性率高于非AID者(P<0.05)。DFS陽性的AID患者存在不同的臨床表現(xiàn)，而實(shí)驗(yàn)室以抗核抗體譜(ANAs)中的15項(xiàng)特異性抗體均陰性為主要特征，對(duì)于DFS陽性者需進(jìn)一步檢測(cè)其特異性的抗DFS70抗體。而在國內(nèi)的其他研究報(bào)道中，DFS在ANA陽性者中的陽性率分別為2.31%[46]、1.69%[49]、1.27%[50]，且抗DFS70抗體陽性者在成人自然流產(chǎn)(28.0%)、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(22.5%)患者中多見。近期的一項(xiàng)國內(nèi)大樣本分析中顯示，DFS占ANA陽性者的3.10%[51]，DFS陽性者與皮膚病、脫發(fā)、不明原因的血栓和產(chǎn)科并發(fā)癥相關(guān)。另外，在日本的研究報(bào)道中，抗DFS70抗體在健康人群的陽性率為16.4%，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、混合結(jié)締組織病(MCTD)、系統(tǒng)性硬化癥(SSc)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎(PM/DM)、干燥綜合征(SS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的陽性率分別為22.1%、14.3%、14.3%、3.0%、21.3%、18.1%，AID(除PM/DM以外)與健康人群的抗DFS70抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。但單獨(dú)抗DFS70抗體在健康人群的陽性率高于上述AID(除RA以外)[11]。

在健康人群中，對(duì)不同種族和地理區(qū)域的7個(gè)國家的獻(xiàn)血者中的抗DFS70抗體進(jìn)行分析，抗DFS70抗體的陽性率為1.2%～8.2%，以年輕女性者中為多見[52]。且對(duì)40例抗DFS70抗體陽性的健康者隨訪4年，3例抗DFS70抗體陽性的健康兒童隨訪3年，均無隨訪者進(jìn)展為系統(tǒng)性AID[53- 54]。在SLE的國際隊(duì)列研究中，抗DFS70抗體的陽性率為7.1%，并與肌肉骨骼的活動(dòng)性、抗β2糖蛋白Ⅰ抗體有關(guān)，但單獨(dú)抗DFS70抗體的陽性率僅為1.1%[55]。在一項(xiàng)對(duì)PLN和腎病理性活動(dòng)的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)活檢證實(shí)的LN患者中抗DFS70抗體的陽性率(19.6%)與NLN-SLE患者 (19.8%)相當(dāng)，但顯著高于CKD患者(13.4%)和健康者(9.0%)，且抗DFS70抗體與抗dsDNA抗體滴度相關(guān)，這表明抗DFS70抗體在LN患者中可能不具有保護(hù)作用，但可能具有作為反映LN亞類和病理活性的非組織學(xué)生物標(biāo)志物的潛在作用[56]。在其他AID的臨床研究中，SS患者中的抗DFS70抗體陽性率為9.7%，但對(duì)于不同的檢測(cè)方法具有不同的陽性檢出率[47]。在27例抗DFS70抗體陽性的SS患者中，21例合并抗SSA抗體陽性，單獨(dú)的抗DFS70抗體陽性率僅為1.0%。在SSc患者中的抗DFS70抗體陽性率為1.5%，通常合并SSc相關(guān)自身抗體，單獨(dú)抗DFS70抗體未見。PM/DM患者中的抗DFS70抗體陽性率為3.5%，通常合并肌炎特異性自身抗體，單獨(dú)抗DFS70抗體陽性率為0.9%。有文獻(xiàn)報(bào)道抗DFS70抗體可能與DM的預(yù)后相關(guān)，在抗DFS70抗體合并抗MDA5抗體的3例DM患者中，1例死亡患者的抗DFS70抗體滴度下降，但確切的相關(guān)性未明。UCTD患者的抗DFS70抗體陽性率為8%～40%，在一項(xiàng)單中心的91例UCTD患者中，使用CLIA、LIA檢測(cè)抗DFS70抗體，陽性者以年輕者多見，但與抗ENA抗體、抗dsDNA抗體無相關(guān)性。另外，抗DFS70抗體在UCTD患者中的臨床特征未見差異。抗DFS70抗體陽性能否作為UCTD患者進(jìn)展為系統(tǒng)性AID的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，仍有待進(jìn)一步深入研究。

另外，抗DFS70抗體可見于特應(yīng)性皮炎、慢性疲勞綜合征、纖維肌痛、視網(wǎng)膜變性、白內(nèi)障及腫瘤等患者[48，57]。如在ANA陽性的前列腺癌患者DFS的陽性率為14%，抗DFS70抗體的陽性率為18.4%[57]。而在其他腫瘤患者(如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤)DFS的陽性率為1.8%(6/334)[58]。

總之，臨床研究初步明確單獨(dú)的抗DFS70抗體陽性可作為系統(tǒng)性AID的排除指標(biāo)，但由于DFS、抗DFS70抗體可存在于多種疾病中，不同研究報(bào)道仍存在不同的研究結(jié)論，確切的臨床相關(guān)性仍有待深入研究。