阮澤松 陳云豐

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233

糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DO)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，由糖尿病相關(guān)的血糖調(diào)節(jié)受損、微血管損傷、晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積等病理因素導(dǎo)致[1-2]，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。目前常規(guī)用來(lái)治療骨質(zhì)疏松的藥物對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松療效有限[3]，存在增加非典型性骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[4]，如何安全有效地進(jìn)行糖尿病性骨質(zhì)疏松治療成為亟待解決的難題。

近年來(lái)，許多研究報(bào)道了關(guān)于運(yùn)用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療骨質(zhì)疏松的潛在療效。MSCs來(lái)源廣泛，在體內(nèi)體外均能誘導(dǎo)成骨分化[5]，此外，諸如改善胰島素抵抗、促進(jìn)微血管的生長(zhǎng)等特性在治療糖尿病性骨質(zhì)疏松擁有巨大前景[6]。但干細(xì)胞療法存在諸如免疫排斥、惡變等安全問(wèn)題與倫理道德問(wèn)題[7]，阻礙其在臨床治療中的發(fā)展與運(yùn)用。

間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos)是MSCs旁分泌形成的一類胞外囊泡，介導(dǎo)MSCs在多種疾病中的治療作用[8-9]。應(yīng)用MSC-Exos治療骨質(zhì)疏松也具有一定療效[10-12]，且能夠避免免疫排斥等風(fēng)險(xiǎn)[13]，有望發(fā)展成為一種醫(yī)治糖尿病性骨質(zhì)疏松的新手段。本文綜述了MSC-Exos與糖尿病性骨質(zhì)疏松相關(guān)研究，探求將MSC-Exos應(yīng)用于治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制。

1 MSC-Exos的一般特性

外泌體是一類由脂質(zhì)雙分子層包含多種蛋白質(zhì)、脂肪、核酸形成的胞外囊泡。其中，蛋白質(zhì)可分為膜蛋白和囊內(nèi)蛋白，分別參與細(xì)胞的識(shí)別與外泌體的釋放過(guò)程[14]。脂肪酸、膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂等脂質(zhì)能增強(qiáng)外泌體的穩(wěn)定性，促進(jìn)外泌體的出芽釋放[15]。核酸如DNA、miRNA能在外泌體保護(hù)不被降解，確保在受體細(xì)胞中參與基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的調(diào)節(jié)[16]。外泌體通過(guò)其包含的蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，參與體內(nèi)組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理生理過(guò)程[17]。

最初認(rèn)為MSCs在治療中發(fā)揮的作用是通過(guò)增殖并分化成為效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生，然而最近諸多研究表明MSCs通過(guò)其旁分泌產(chǎn)生的外泌體發(fā)揮治療效果。最早由Lai等[18]在2010年首次發(fā)現(xiàn)了MSC-Exos對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷的修復(fù)作用，隨后陸續(xù)揭示了MSC-Exos在肺、肝等疾病中的治療作用[8-9]。其中，也有相關(guān)研究指出MSC-Exos對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨功能具有促進(jìn)作用，有效改善骨質(zhì)疏松小鼠骨量情況[19]，是潛在的骨代謝疾病治療方法。

2 糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制

糖尿病性骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為繼發(fā)于糖尿病后出現(xiàn)的骨量降低、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，主要涉及以下機(jī)制：(1)高血糖水平使得正常骨組織的生長(zhǎng)代謝受到影響。其中BMSCs由于凋亡增加導(dǎo)致數(shù)量明顯減少，并且其分化為成骨細(xì)胞的能力減弱，導(dǎo)致了“成骨”與“破骨”之間的平衡被破壞。此外，糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs趨向脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致髓腔內(nèi)脂肪堆積，進(jìn)一步抑制了成骨分化[20]。(2)糖尿病的微血管病變導(dǎo)致骨的血供受限，降低了成骨龕的氧氣以及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，骨組織的正常代謝受到影響。同時(shí)由于局部缺氧，髓腔內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，使得原本供氧不足的骨組織病情加重[21]。(3)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是在糖尿病患者體內(nèi)由膠原蛋白的氨基酸殘基與高濃度糖通過(guò)非酶促糖化形成的一類有害代謝物質(zhì)。AGEs在骨組織中的積累會(huì)影響骨骼的結(jié)構(gòu)特性，使得骨脆性增加。AGEs還會(huì)引起局部炎癥水平增加誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，影響骨形成[22-23]。(4)胰島素分泌不足或胰島素抵抗可引起骨組織能力代謝障礙，導(dǎo)致成骨減少[24]；一些治療糖尿病的藥物對(duì)骨形成的過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生不利影響[25]。此外，其他并發(fā)癥如糖尿病腎病導(dǎo)致血鈣、維生素D水平降低，將加重骨質(zhì)疏松水平[26]。

3 MSC-Exos對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制

3.1 MSC-Exos參與調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化

如何實(shí)現(xiàn)促進(jìn)BMSCs向成骨分化是恢復(fù)正常骨組織密度的核心問(wèn)題，在這過(guò)程中MSC-Exos可通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用。

3.1.1MSC-Exos能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡：Yang等[27]評(píng)估臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)BMSCs的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自外泌體的miRNA-1263抑制了受體細(xì)胞中Mob1蛋白的活性并激活Hippo通路中的效應(yīng)蛋白YAP，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs的保護(hù)。Zhu等[28]在體外模擬高濃度葡萄糖條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了在模擬高血糖狀態(tài)下MSC-Exos對(duì)BMSCs的增殖也具有促進(jìn)作用。

3.1.2MSC-Exos能夠促進(jìn)BMSCs向成骨分化：成骨細(xì)胞具有合成、分泌礦化骨基質(zhì)的功能，其生成受損是骨質(zhì)疏松致病過(guò)程的關(guān)鍵。Qi等[29]利用人源性多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(hiPSC-MSC)產(chǎn)生的外泌體處理BMSCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中RUNX-2、COL1和ALP等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，體外成骨實(shí)驗(yàn)如ALP染色與茜素紅染色結(jié)果也顯示骨形成增強(qiáng)。越來(lái)越多的研究表明這一誘導(dǎo)成骨的效應(yīng)可能是通過(guò)外泌體中的miRNA介導(dǎo)。Qin等[10]證實(shí)BMSC源性外泌體中miRNA-196a、miRNA-27a和miRNA-206促進(jìn)BMSC向成骨分化，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了除這三類microRNA之外，外泌體中還存在其他影響B(tài)MSC成骨分化的成分。

3.1.3MSC-Exos能抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞的分化：MSCs在糖尿病患者體內(nèi)趨向脂肪細(xì)胞分化并出現(xiàn)骨髓脂肪堆積，增加的脂肪細(xì)胞上調(diào)PPARγ、CEBPα和CEBPδ等基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響B(tài)MSCs的分化以及抑制成骨細(xì)胞的成骨作用[30-31]。可見，有效地抑制BMSCs脂肪分化能夠恢復(fù)正常的成骨水平。有研究報(bào)道BMSC源性外泌體中的miRNA126-3p可降低BMSCs中FTO蛋白的活性，抑制其分化為脂肪細(xì)胞。此外，miRNA126-3p還通過(guò)抑制MYC/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs的成骨分化[32-33]。

3.2 MSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響

成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互作用以促進(jìn)正常骨生長(zhǎng)及維持合理骨密度，但這種平衡狀態(tài)在糖尿病性骨質(zhì)疏松中被打破。MSC-Exos除影響B(tài)MSCs的分化外，還可通過(guò)調(diào)節(jié)“成骨”與“破骨”的水平來(lái)參與骨代謝。Yang等[34]研究表明來(lái)自BMSC源性外泌體中的lncRNA-MALAT1進(jìn)入成骨細(xì)胞后與胞內(nèi)miRNA-34c結(jié)合，增加STAB2的表達(dá)并增強(qiáng)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、ATF4的活性，促進(jìn)成骨作用。MALAT1也可通過(guò)抑制miR-22-5p促進(jìn)RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞溶骨作用[35]，但是整體來(lái)看，經(jīng)MSC-Exos治療的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型表現(xiàn)為骨量增加，骨質(zhì)疏松緩解[34]。其他的研究表明MSC-Exos對(duì)破骨細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)存在爭(zhēng)議，Hu等[36]研究臍帶間充質(zhì)源性外泌體對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)外泌體中的CLEC11A通過(guò)抑制RANKL的表達(dá)從而表現(xiàn)出對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收的抑制作用。Chen等[11]研究經(jīng)尿源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療后的骨質(zhì)疏松小鼠的骨代謝水平，通過(guò)qPCR發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因如Ocn、Alp和Runx2的mRNA含量增加明顯；而破骨細(xì)胞相關(guān)基因如Trap、Mmp9、Ctsk受到了抑制，證實(shí)了外泌體中CTHRC1和OPG產(chǎn)生的促成骨和抗破骨作用。

在這些研究中，不同來(lái)源的MSC-Exos都促進(jìn)了成骨細(xì)胞的骨形成作用，然而對(duì)于破骨細(xì)胞的作用尚無(wú)確定結(jié)論。因此仍需進(jìn)一步比較不同來(lái)源的MSC-Exos的作用，并篩選出能高效治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的類型。

3.3 MSC-Exos改善骨組織的血供

正常情況下骨的血供滿足組織必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并提供激素、生長(zhǎng)因子等刺激骨的生長(zhǎng)。而在糖尿病的病理?xiàng)l件下，血供受損無(wú)法維持骨組織正常的生長(zhǎng)代謝[21]。而MSC-Exos攜帶的物質(zhì)能夠通過(guò)參與多種信號(hào)通路影響血管生成，改善血供不足的情況。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一類通過(guò)趨化內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)耦合骨與血管生長(zhǎng)的蛋白[37]。MSC-Exos包含有VEGF以及促進(jìn)靶細(xì)胞VEGF表達(dá)的多種物質(zhì)，通過(guò)激活靶細(xì)胞的PIK3/AKT/mTOR通路以及抑制PTEN的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成來(lái)提高成骨水平[38-39]。除VEGF通路外，MSC-Exos也可通過(guò)NOTCH通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生類似的作用[40]。Gonzalez-King等[41]對(duì)過(guò)表達(dá)HIF-1的MSC-Exos進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NOTCH通路配體Jagged1與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后能促進(jìn)胞內(nèi)NICD形成，影響靶基因如HES1、HEY2的表達(dá)，使得內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)的形成增加。

除誘導(dǎo)血管生成外，MSC-Exos還能夠改善AGEs誘導(dǎo)的微血管病變。糖尿病引起的血管鈣化是發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)因素[42]。Wang等[43]在模擬的糖尿病環(huán)境下發(fā)現(xiàn)BMSCs產(chǎn)生的外泌體中miRNA146a含量增加，通過(guò)減少TXNIP基因在血管平滑肌組織中的表達(dá)，抑制了血管平滑肌鈣化。應(yīng)用MSC-Exos治療能有效促進(jìn)血管生成和改善血管的順應(yīng)性，恢復(fù)骨骼正常的血液供應(yīng)，促進(jìn)骨形成。

3.4 MSC-Exos對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的作用

針對(duì)糖尿病的病理機(jī)制，選擇合適的治療和預(yù)防手段能有效提高糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療效果。Sun等[44]研究結(jié)果表明MSC-Exos能夠協(xié)同胰島素激活A(yù)KT、IRS-1信號(hào)通路改善胰島素抵抗，增加靶組織GLUT2、GLUT4的表達(dá)以促進(jìn)對(duì)葡萄糖的攝取及利用。Exos還能夠緩解鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損害，通過(guò)恢復(fù)胰島素受體底物1和蛋白激酶B的磷酸化改善胰島素分泌并維持血糖穩(wěn)定，加強(qiáng)肝糖原的儲(chǔ)存以減少AGEs的產(chǎn)生與蓄積?？梢奙SC-Exos恢復(fù)組織對(duì)葡萄糖的利用這一特性可能成為其治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制。

糖尿病腎病是最常見的糖尿病并發(fā)癥。腎臟的病變導(dǎo)致尿蛋白丟失增加，血鈣、維生素D水平降低[26]。因此改善糖尿病的腎損害，維持血鈣、維生素D正常水平也是治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的重要部分。Jin等[45]發(fā)現(xiàn)MSC-Exos中的miRNA-486可降低足細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)，通過(guò)抑制mTOR的磷酸化來(lái)下調(diào)足細(xì)胞的凋亡水平，有效緩解了糖尿病腎病的進(jìn)程。此外，MSC-Exos在對(duì)諸如糖尿病足、周圍神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變等其他糖尿病并發(fā)癥也具有一定的治療作用[46-48]。可見應(yīng)用MSC-Exos能夠兼顧對(duì)原發(fā)病及其他繼發(fā)疾病的治療，以有望切實(shí)提高治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的效果。

4 MSC-Exos臨床的應(yīng)用展望

糖尿病及其相應(yīng)的并發(fā)癥如糖尿病性骨質(zhì)疏松儼然已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，亟待有效解決。應(yīng)用MSC-Exos治療糖尿病性骨質(zhì)疏松切合其發(fā)病機(jī)制，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型上具有一定效果。但是將其真正運(yùn)用于臨床還需解決許多問(wèn)題：(1)MSC-Exos治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制并不完全明確?，F(xiàn)有的研究表明多種miRNA與蛋白質(zhì)參與疾病的治療。此外，不同組織來(lái)源的MSC-Exos對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制和治療效果存在差異，有待進(jìn)一步研究以明確應(yīng)用于疾病治療的最佳MSC-Exos來(lái)源。(2)將MSC-Exos通過(guò)靜脈注射后會(huì)在肝、肺等組織富集[49]，無(wú)法靶向到損傷部位。將MSC-Exos摻入β-TCP支架中可直接在骨缺損部位發(fā)揮療效[29]，后續(xù)可通過(guò)尋找契合MSC-Exos生物活性功能的可降解生物支架材料以最大化其治療效果。(3)MSC-Exos能夠高效介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，可作為治療用蛋白、核酸的輸送載體，通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)信號(hào)通路發(fā)揮治療作用[41]。利用這一特性，可設(shè)計(jì)運(yùn)載特定生物活性分子以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療效果。若能修飾其表面蛋白，將MSC-Exos高效地靶向?qū)?yīng)病變組織，可明顯減少不良反應(yīng)并提升療效。

MSC-Exos的優(yōu)秀特性為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供了新的方向。隨著MSC-Exos相關(guān)研究不斷發(fā)展，對(duì)其認(rèn)識(shí)更加明確，MSC-Exos將成為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松有效的新方案。