趙述芳，龔建萍，李 倩，沈志強

(昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

近年來，隨著經(jīng)濟條件的不斷改善，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣也在不斷改變，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的發(fā)病率明顯提高。UC是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，又稱為非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，另一種典型的炎癥性腸病是克羅恩病(CD)，兩者均是以腸黏膜的慢性和間歇性炎癥為特征[1-3]的原發(fā)性慢性胃腸道復(fù)發(fā)疾病。UC發(fā)病率遠遠高于CD，臨床以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重、發(fā)熱等為主要癥狀。該病大多數(shù)病程緩慢,有反復(fù)發(fā)作傾向,少數(shù)病例會急性暴發(fā),病情兇險。由于該病的這些特點，目前還不能復(fù)制出一個完全符合人類UC發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)的實驗動物模型。然而其發(fā)病原因涉及環(huán)境、遺傳、免疫及炎癥介質(zhì)等因素[4-5]，并且因其具體病因、發(fā)病機制、疾病發(fā)展規(guī)律等尚不明確而被認為是胃腸道最嚴重且難治的疾病之一。因此急需一個完全符合人類UC發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)的理想實驗動物模型來對這些方面進行深入的研究。目前建立UC實驗動物模型的方法較多，根據(jù)模型建立的機制，大致可以分為化學(xué)誘導(dǎo)模型、細胞或組織過繼轉(zhuǎn)移模型、復(fù)合模型、中醫(yī)模型和基因工程模型五大類?；瘜W(xué)誘導(dǎo)模型因為操作簡便而應(yīng)用最廣泛[6]，復(fù)合模型和細胞或組織過繼轉(zhuǎn)移模型是目前比較經(jīng)典的造模方法，但隨著對UC的深入研究，逐漸發(fā)現(xiàn)UC是一種與多基因密切相關(guān)的疾病[7-8]，因此，UC的基因工程動物模型備受關(guān)注。與前四類UC動物模型相比，基因工程模型成本高，造模條件和技術(shù)要求更高，但因其通常是對特定的一個或若干個基因進行修飾，具有極強的針對性，從而在闡明相關(guān)基因在疾病發(fā)病機制、疾病發(fā)展規(guī)律中作用時具有極大的優(yōu)勢，這對未來UC的進一步深入研究具有重大意義。UC的基因工程動物模型大致分為基因敲除模型和轉(zhuǎn)基因模型[9]以及基因工程復(fù)合模型3種，現(xiàn)將這三類UC的基因工程動物模型的研究及進展做一綜述。

1 基因敲除模型

基因敲除模型分為傳統(tǒng)基因敲除模型和條件性基因敲除模型2種[10]。傳統(tǒng)基因敲除模型是現(xiàn)有的基因被滅活或用人造DNA片段代替待敲除的目的基因的方法來建立模型。而條件性基因敲除模型是從身體的單個器官敲除特定的基因來建立的模型[11]?？傊畠煞N方法均使特定的基因缺失，從而產(chǎn)生腸道炎癥。

1.1白細胞介素-10(IL-10)基因敲除模型 IL-10由T細胞、B細胞和巨噬細胞等產(chǎn)生，它能抑制巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，如白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α),抑制輔助性T細胞1(Th1)、自然殺傷細胞(NK)和巨噬細胞的功能[12]。因此IL-10-/-的小鼠導(dǎo)致CD4+Th1細胞的激活以及降低了它們的抑制因子調(diào)節(jié)性T細胞的水平，導(dǎo)致了炎癥的發(fā)生[13-14]。IL-10-/-小鼠自發(fā)地在整個腸段發(fā)生慢性炎癥，但主要發(fā)生在十二指腸、空腸近端和升結(jié)腸。由于結(jié)腸炎的發(fā)展是可預(yù)測的，該模型可用于研究結(jié)腸炎不同階段血清和腸道蛋白的性質(zhì)，尋找IBD的疾病標志物，并研究飲食對炎癥的影響[15]。此外，由于結(jié)腸炎只有在接觸共生菌后才會發(fā)生，這個模型對于研究結(jié)腸上皮和腸道微生物區(qū)系之間復(fù)雜的相互作用是有用的。

1.2多藥耐藥蛋白1a缺失模型(Mdr1a) Mdr1a基因是小鼠多藥耐藥1a基因，該基因參與上皮細胞通透性的調(diào)節(jié)[16]。該基因缺失，上皮細胞通透性增加，緊密連接蛋白磷酸化降低，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。在常規(guī)飼養(yǎng)的情況下，Mdr1a-/-小鼠在5～8周齡[17]時可發(fā)展為自發(fā)性的、菌群依賴的結(jié)腸炎[15]。組織病理學(xué)改變類似于UC，其病理與人類CD相似，且炎性結(jié)腸組織的基因表達變化與IBD患者的基因調(diào)控重疊[18]，為研究腸上皮屏障功能、免疫調(diào)節(jié)、感染性共觸發(fā)因素和新的治療方法提供了一個很有價值的IBD模型[19]。此外，該結(jié)腸炎是在接觸共生菌后發(fā)生的，該模型也可以研究微生物區(qū)系與IBD發(fā)病機制之間的相互作用。

1.3黏蛋白2缺失模型(Muc2) 通常認為，UC發(fā)病與正常結(jié)腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)或功能缺陷有關(guān)。正常結(jié)腸黏膜屏障主要成分是杯狀細胞釋放的Muc2[20]，它是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，一旦釋放，它就會水合，形成黏液層，防止微生物和管腔抗原接觸上皮表面[21]。有研究表明，UC患者結(jié)腸組織出現(xiàn)杯狀細胞數(shù)量減少，黏液層比正常黏液層薄的現(xiàn)象。同樣的，缺乏Muc2或Muc2錯義突變損害其釋放和功能的小鼠，在3個月大的時候發(fā)展為自發(fā)性結(jié)腸炎[20]，引起以腸上皮細胞扁平和潰爛為特征的異常形態(tài)，炎癥細胞輕度浸潤，增殖增加，結(jié)腸細胞分化減少，小鼠結(jié)腸組織中白細胞介素-1β(IL-1β)表達上調(diào)。盡管杯狀細胞產(chǎn)生的黏膜防御因子抵抗素樣分子-β(RELM-β)也急劇上調(diào)[22]，但其在特定微生物群存在下可能會導(dǎo)致不同嚴重程度的結(jié)腸炎[23]。

Muc2-/-小鼠結(jié)腸炎模型可從多個方面來研究上皮屏障的生理作用以及屏障功能受損在UC發(fā)病、發(fā)展中的作用，并為通過降低腸道屏障功能的損害和限制免疫反應(yīng)來實現(xiàn)黏膜免疫穩(wěn)態(tài)的UC治療方法的相關(guān)研究提供了一個有價值的動物模型[24]。

1.4TRUC(T-bet-/-×RAG2-/-ulcerative colitis)模型 由于先天和適應(yīng)性免疫的遺傳缺陷，TRUC模型(T-bet-/-×RAG2-/-)小鼠在3周齡之前表現(xiàn)出結(jié)腸炎的體征，然后逐漸發(fā)展為早期發(fā)作的自發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎[25]。其發(fā)病機制[26]是T-bet-/-小鼠通過模式識別受體(PRRs)信號激活的樹突狀細胞釋放TNF-α、IL-1和IL-23。IL-23和IL-1共同刺激先天性淋巴細胞(ILCs)分泌IL-17A。TNF-α可以誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞凋亡[27]，且與IL-17A具有協(xié)同作用，促進中性粒細胞的產(chǎn)生，中性粒細胞釋放的組織損傷介質(zhì)加劇了TRUC小鼠的結(jié)腸屏障功能障礙。此外，該模型結(jié)腸炎的發(fā)生還依賴于腸道微生物組。在無菌條件下的TRUC小鼠不會發(fā)展為結(jié)腸炎，只有在肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌等特定的腸道微生物存在的情況下才會引發(fā)TRUC結(jié)腸炎[28]。TRUC小鼠的自發(fā)性結(jié)腸炎在許多方面類似于人類UC。炎癥主要發(fā)生在遠端，僅限于黏膜或黏膜下層，并與上皮異常增生和結(jié)直腸癌的高發(fā)有關(guān)[26]。

TRUC小鼠為評估腸道微生物群在結(jié)腸炎發(fā)病機制中的作用以及表征腸道微生物群對治療干預(yù)的反應(yīng)提供了一種易于處理的模型[25]。此外該模型還可用于研究固有免疫和適應(yīng)性免疫與UC發(fā)病機制的相關(guān)性。

1.5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3缺失模型(Stat3)Stat3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，是CD和UC的易感基因[29]，它是控制Th17分化和上皮再生等廣泛適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。Stat3在IL-10介導(dǎo)的髓樣細胞信號通路中起著關(guān)鍵的作用，Stat3缺失小鼠的巨噬細胞沒有表現(xiàn)出任何由IL-10介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)[30]。此外，有研究表明，盡管CD4+T細胞中Stat3的激活誘導(dǎo)了結(jié)腸炎的發(fā)生[31-32]，但巨噬細胞或中性粒細胞特異性的Stat3敲除小鼠在20周齡時自發(fā)地患上了結(jié)腸炎，在沒有T細胞和B細胞的情況下巨噬細胞或中性粒細胞特異性Stat3敲除小鼠又不會導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)生[33]。此外，上皮細胞中Stat3的特異性缺失也未能導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎[33]。這些發(fā)現(xiàn)提示Stat3介導(dǎo)的獲得性免疫激活在結(jié)腸炎中起致病作用，而Stat3介導(dǎo)的天然免疫激活在結(jié)腸炎中起保護作用。

該模型可用于研究轉(zhuǎn)錄因子在腸道中的生物學(xué)功能以及研究Stat3基因在結(jié)腸炎中的作用，為進一步研究UC的發(fā)病機制和治療手段提供一定的指導(dǎo)意見。

2 轉(zhuǎn)基因模型

與基因敲除模型不同，UC轉(zhuǎn)基因模型是將目的基因拷貝，從而導(dǎo)致特定基因的過度表達[10]。與基因敲除模型類似，轉(zhuǎn)基因模型也有傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因模型和條件性細胞特異靶向轉(zhuǎn)基因模型2種。

2.1白細胞介素-7(IL-7)轉(zhuǎn)基因模型 IL-7具有調(diào)節(jié)黏膜淋巴細胞作用，對胸腺T細胞的分化增殖有影響。IL-7轉(zhuǎn)基因模型中IL-7過度表達，從而激活大量黏膜淋巴細胞，小鼠在4～12周齡左右自發(fā)發(fā)展為結(jié)腸炎[33]。該模型是一種傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因模型，IL-7轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸黏膜 IL-7 mRNA的過度表達，導(dǎo)致腸道中CD4+T細胞和中性粒細胞浸潤[33]。該模型適合用于T細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病機制以及針對T細胞功能治療干預(yù)UC的相關(guān)研究[10]。在組織病理學(xué)上與人類UC相似，是研究疾病的良好的工具和載體，但是轉(zhuǎn)基因模型的建立同樣具有相當?shù)募夹g(shù)難度，成本較高。

2.2人類白細胞抗原B27(HLA-B27)轉(zhuǎn)基因模型HLA-B27轉(zhuǎn)基因模型是通過在大鼠或小鼠基因組中插入HLA-B27的基因而培育出來的，HLA-B27是一種人類I類主要組織相容性等位基因，參與抗原呈遞，可自發(fā)引起慢性胃腸道炎癥、關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等炎癥。HLA-B27轉(zhuǎn)基因模型表達人類β2微球蛋白和組織相容性基因HLA-B27，自發(fā)地產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的腸道慢性炎癥，是公認的IBD動物模型[34]。

HLA-B27轉(zhuǎn)基因模型產(chǎn)生的主要是Th1炎癥反應(yīng)，與CD相似，而其結(jié)腸炎的組織學(xué)特征與UC非常相似[34]。HLA-B27轉(zhuǎn)基因模型常用于研究腸道常駐細菌對胃腸道炎癥的急性和慢性階段的作用[10]。

2.3血清反應(yīng)因子(Srf)轉(zhuǎn)基因模型 Srf是一種被各種細胞外刺激激活的轉(zhuǎn)錄因子，過度表達Srf的小鼠表現(xiàn)出多種病理特征，包括UC樣癥狀和胰腺上的生化樣表型[35-36]。Ikeda等[37]采用多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)系統(tǒng)，在胚胎干細胞系(ESCs)的Col1a1位點(在Rosa26中攜帶M2-rtTA)中引入了Dox調(diào)節(jié)的Srf，然后引入了res-mCherry，并將建立的細胞注射到ICR小鼠囊胚中，以產(chǎn)生嵌合小鼠。將4周大的具有類似嵌合體的小鼠給予2 μg/mL的Dox處理4 d或7 d，然后進行Srf過表達的觀察和表型診斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型與人類UC十分類似，腸道炎癥細胞浸潤，導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)上皮脫落和隱窩膿腫，且病變部位與表達異常的Srf區(qū)域一致，并提示Srf過表達可能參與潰瘍性結(jié)腸炎的病理過程[37-38]。因此，該模型可作為研究UC疾病發(fā)病機制、疾病發(fā)展進程的動物模型。

3 基因工程復(fù)合模型

基因工程復(fù)合模型是以基因工程動物為基礎(chǔ)，再與其他手段相結(jié)合，從而產(chǎn)生更符合研究目的、更具有針對性的動物模型。

3.1葡聚糖硫酸鈉(DSS)復(fù)合N-乙酰氨基葡萄糖-6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1，2(GlcNAc6ST-1，-2)雙重敲除模型 Low等[39]選用8周齡GlcNAc6ST-1-/-×GlcNAc6ST-2-/-雄性小鼠與其C57BL/6野生型小鼠產(chǎn)幼鼠。接著將得到的雙重基因敲除小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF)的條件下，自由飲用2%的DSS 1周，再飲用水1周，總共持續(xù)6周便可建立類似人UC的實驗性結(jié)腸炎模型。在DSS的作用下，野生型小鼠和雙重缺失 GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2的小鼠均表現(xiàn)出活動性結(jié)腸炎的體征，包括活動性降低、駝背、腹瀉和便血。組織學(xué)表現(xiàn)也與人類UC相似，出現(xiàn)隱膜炎、隱窩膿腫，甚至在結(jié)腸的遠端至中間部位出現(xiàn)潰瘍性病變。但相比于野生型小鼠，雙重缺失GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2的小鼠產(chǎn)生更嚴重的結(jié)腸炎，出現(xiàn)更多的潰瘍性病變，結(jié)腸固有層的多形核細胞浸潤程度更深，是一個與人類UC相似的實驗結(jié)腸炎模型，可用于UC的相關(guān)研究。此外，一般認為UC的炎癥細胞是通過高內(nèi)皮微靜脈(HEV)樣血管招募的,而N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的6-O-硫酸化與HEV樣血管的作用有關(guān)，且GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2是GlcNAc的6-O-硫酸化反應(yīng)的唯一催化劑[40]。因此，使用GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2雙重缺陷的小鼠的該模型可用于研究GlcNAc的6-O-硫酸化對UC中HEV樣血管的作用[40]，為進一步研究UC的炎癥機制、發(fā)病機制、疾病發(fā)展以及診斷治療方法提供一定的指導(dǎo)意見。

3.2IL-10受體中和抗體(IL-10R mAb)復(fù)合Toll樣受體(TLRs)敲除模型 Carvalho等[41]分別建立了IL-10R mAb復(fù)合TLR5-/-,IL-10R mAb復(fù)合TLR4-/-/TLR5-/-和IL-10R mAb復(fù)合Re-TLR5-/-三種結(jié)腸炎的動物模型。前兩種模型是將6～8周的TLR5-/-、TLR4-/-/TLR5-/-小鼠分別與C57BL/6小鼠回交至10代，然后每周按照1 mg/只的劑量給小鼠腹腔注射IL-10R mAb，連續(xù)4周[41]。在第5周后便能檢測到結(jié)腸炎，模型即被建立。

IL-10R mAb復(fù)合Re-TLR5-/-模型是先將雄性TLR5-/-小鼠與野生雌性C57BL/6J小鼠進行繁殖。將胚胎移植給代孕C57BL/6J小鼠，產(chǎn)生再衍生的TLR5雜合子小鼠(Re-TLR5-/-)，以獲得與C57BL/6J小鼠具有相同或相似腸道菌群的TLR5-/-小鼠[42]。后續(xù)操作同前兩種模型，同樣到第5周結(jié)腸炎模型即可建立。

TLR5-/-和Re-TLR5-/-小鼠在用IL-10 RmAb處理后均出現(xiàn)了結(jié)腸炎。IL-10R mAb復(fù)合TLR5-/-模型呈現(xiàn)出結(jié)腸腫大、增厚、出血，脾腫大，糞便松散等特點。且組織病理學(xué)特征為隱窩膿腫和隱窩變形或丟失。但IL-10R mAb復(fù)合Re-TLR5-/-模型使用了Re-TLR5-/-小鼠后可顯著減輕其自發(fā)性結(jié)腸炎，但仍具有低度炎癥和代謝綜合征的特征[42]。TLR5-/-小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎的程度與其菌群的組成有關(guān)，使用Re-TLR5-/-小鼠便可獲得與特定的小鼠具有相同或相似腸道菌群的TLR5-/-小鼠[42]。

像TLR5-/-小鼠一樣，TLR4-/-/TLR5-/-小鼠在IL-10R被阻斷2周后體重開始減輕。組織病理學(xué)方面，小鼠表現(xiàn)出隱窩變形，潰瘍和中性粒細胞廣泛浸潤到漿膜中。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可增加促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo),TLR4缺失便可減少促炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少至一定程度可以預(yù)防TLR5缺失的小鼠發(fā)展為自發(fā)性結(jié)腸炎，但用IL-10 RmAb處理后，由于干擾其內(nèi)源性抗炎機制，因此會表現(xiàn)出嚴重的結(jié)腸炎[41]。

Carvatho等[41]在3種模型中觀察到IL-10R功能阻斷會使TLR5-/-小鼠誘發(fā)結(jié)腸炎，而IL-10R功能的阻斷與腸道菌群組成的改變有關(guān)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)阻斷IL-10信號后，TLR5缺失的小鼠易患由IL-1β依賴的免疫失調(diào)所引發(fā)的結(jié)腸炎。因此通過這3個模型，可以進一步研究結(jié)腸炎中腸道菌群組成與IL-10、 IL-1β之間的關(guān)系，以及腸道菌群組成、IL-10、 IL-1β在結(jié)腸炎中的作用，進而為結(jié)腸炎的診斷和治療提供新的思路。

3.3他莫昔芬復(fù)合kindlin 1/kindlin 2雙重敲除模型 先前有研究表明UC的一個重要發(fā)病特征是固有的黏液磷脂酰膽堿(PC)含量低[43]。Stremmel等[44]為了研究UC中固有的PC含量低是否與細胞旁運輸?shù)木o密連接(TJs)缺失有關(guān)，建立了他莫昔芬復(fù)合kindlin 1/kindlin 2雙重敲除模型。kindlin 1和kindlin 2可以激活整合素，促進細胞黏附到基底膜或細胞與細胞的連接處[45]。該模型長時間暴露于他莫昔芬后，由于黏膜缺損，便可建立成熟的UC表型。他們利用12周齡、體重約31 g的腸道特異性缺失villin-Cre依賴的kindlin 1和2的小鼠，每天9：00按照0.2 mg/只的劑量給小鼠腹腔注射他莫昔芬，持續(xù)3 d即可建立UC模型[44]。在暴露于他莫昔芬2 d后，并未出現(xiàn)顯著的炎癥，但在電鏡下均發(fā)現(xiàn)TJ形態(tài)缺陷。第3天后，該模型在回腸和結(jié)腸中出現(xiàn)了類似于UC表型的明顯黏膜炎癥，糞便無定形、黏稠且含有血液，組織學(xué)呈現(xiàn)出結(jié)腸潰瘍和水腫，隱窩結(jié)構(gòu)、黏膜和黏膜下層炎癥以及嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤。最后，他們證明了他莫昔芬復(fù)合kindlin 1/kindlin 2雙重敲除模型導(dǎo)致TJ缺失，TJ破壞導(dǎo)致PC含量降低，因此黏液PC分泌受損是UC的病理生理特征，并導(dǎo)致與人UC相似的黏膜炎癥[44]。這種新的UC基因工程復(fù)合小鼠模型類似于人的UC病理生理學(xué)，因此可用于進一步的實驗研究。

4 小 結(jié)

超過400萬人受到IBD的困擾，盡管過去十年來在發(fā)病機制、治療方面都取得了一些進展，但目前UC的確切發(fā)病機制并未完全闡明，而且UC的一線治療僅限于免疫抑制和抗炎藥物，因此仍需在這些方面進行進一步的研究，而進行相關(guān)研究就需要一個理想的UC動物模型。

在過去的幾十年里，已經(jīng)發(fā)展出幾十種不同的IBD動物模型。雖然它們在研究疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的潛在機制時具有巨大的價值，也為研究各種因素參與IBD的發(fā)病機制和評估不同的治療策略提供了廣泛的選擇。但人類UC特別復(fù)雜，這些模型通常并不代表人類疾病的復(fù)雜性，不能全面地模擬人類UC的病情，在研究中常常缺乏合適的UC模型。因此，還需對UC基因工程動物模型進行進一步深入的研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。