李杰 尹發(fā)明 王淵 王強 劉雋陽 袁偉 喬海法**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西省針藥結(jié)合重點實驗室，陜西 咸陽 712046；3.咸陽市神經(jīng)生物學(xué)(針灸)重點實驗室，陜西 咸陽 712046；4.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266000)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)屬于中醫(yī)“癡呆”范疇，近年來中醫(yī)藥在VD的研究中取得了顯著的進步[1]。VD是指由一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害而引發(fā)的獲得性智能損害綜合征，臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、辨識等認知功能障礙，嚴重影響著患者的生活質(zhì)量[2-3]。因此，中醫(yī)、西醫(yī)開展VD動物模型實驗研究，對認識該病的發(fā)病特點、病理病機，以及尋找最佳治療方案具有重要意義。目前，部分中西醫(yī)研究者開展VD模型大鼠實驗研究，常常缺少一些重要的環(huán)節(jié)，這些因素可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響，為了使該模型實驗?zāi)軌蛴行蜻M行，現(xiàn)做此綜述，供研究者參考[4-6]。

1 模型動物的選擇

VD出現(xiàn)的認知障礙，主要是指由腦血管損傷引起的，腦小血管病變是其最常見的病變。根據(jù)VD形成的特點，用于VD造模的動物也要滿足兩個基本條件：一是所選動物腦血管解剖特點要和人腦相似，二是該動物神經(jīng)系統(tǒng)和感覺運動系統(tǒng)應(yīng)高度發(fā)達，對缺血、缺氧等刺激能準確感知并做出迅速反應(yīng)[7-9]。在VD動物實驗研究中，選擇大鼠作為VD模型最為常見，因為大鼠符合上述兩個條件，并且具有易于操作、生命力頑強、可控性強、造模后便于進行各種檢測等優(yōu)點。因此，大鼠成為VD模型的首選的動物[10]。

2 造模前動物篩選

從動物實驗中心購買回大鼠后，首先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，然后運用Morris水迷宮定位航行試驗進行評測篩選,記錄大鼠找到平臺的時間，如果大鼠在2 min內(nèi)找到平臺(逃避潛伏期)，記錄2 min內(nèi)實際逃避潛伏期時間；如果在2 min內(nèi)未找到隱蔽目標平臺，將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期時間記錄為2 min[11]。以大鼠逃避潛伏期作為大鼠認知功能的標準，對大鼠進行4 d訓(xùn)練(1次·d-1)，記錄每次的測試成績，剔除體質(zhì)比較弱、經(jīng)過訓(xùn)練最終仍游泳障礙，以及測試成績不符合本次研究標準的大鼠[12]。

3 模型制備方法

目前運用的VD大鼠模型制備方法主要有血管阻斷法、血管栓塞法，以及其他因素引起的模型，其中，比較常用的為血管阻斷法和栓塞法。血管阻斷法包括永久性結(jié)扎和間斷性夾閉血管，栓塞法是運用不同材料進行血管阻塞。常用的方法具體操作如下。

3.1血管阻斷法 血管阻斷法是最為常用的造模方式，主要有永久性結(jié)扎或者間斷性夾閉頸部動脈血管。雙側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)永久性結(jié)扎是國內(nèi)最為常用的VD大鼠模型建造方法[13-15]，其操作為充分暴露雙側(cè)頸動脈后，運用鈍性玻璃針分離動脈，對于暴露最明顯的動脈部位，運用3～4號線進行兩端結(jié)扎，然后從中間剪斷，另一側(cè)，運用同樣的方法操作。由于雙側(cè)頸總動脈同時結(jié)扎，大鼠死亡率較高，為了提高VD動物模型存活率，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了一種改良的結(jié)扎法，即結(jié)扎完一側(cè)頸動脈后，3～7 d后結(jié)扎另一側(cè)頸動脈。這種改良后的方法有利于腦側(cè)支循環(huán)的建立，同時，也降低了因腦部血流量突然缺乏引起的大鼠死亡率[16-21]。

間斷性夾閉頸部動脈血管是指分離出雙側(cè)動脈后，運用血管夾夾閉頸動脈10 min，然后松開10 min，重復(fù)上述操作2～3次，也有實驗研究采用夾閉頸動脈20 min，松開10 min，間歇性夾閉數(shù)次。目前，這些研究的夾閉和松開時間沒有統(tǒng)一標準，因此，在間斷性夾閉方法應(yīng)用中仍需進一步研究夾閉和放松的時間長短、間隔時間，以及重復(fù)次數(shù)，權(quán)衡其對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響[22-24]。另外，還有部分研究運用四血管阻斷法，對雙側(cè)椎動脈進行電凝針燒灼，然后分離雙側(cè)頸總動脈，進行夾閉和松開數(shù)次，類似研究的夾閉時間和松開持續(xù)時間及間隔時間仍舊缺乏統(tǒng)一標準[25]。

3.2血管栓塞法 血管栓塞法是采用不同材料作為栓子，如血凝塊、石蠟、絲線等，也是VD造模的常用方法。血管栓塞法和血管阻斷法造模方法原理相似，均為通過阻斷大腦中動脈血流，造成相應(yīng)部位組織缺血，引起神經(jīng)組織損傷，形成VD模型[7]。

4 模型鑒定

模型成功與否直接關(guān)系到實驗結(jié)果的可靠性，在造模完成后，要做好模型的鑒定。有研究是以大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分配合逃避潛伏期來判斷造模是否成功[26-28]，有研究[29]以5級評分法對大鼠神經(jīng)行為學(xué)進行評分：無神經(jīng)損傷癥狀為0分；大鼠腦損傷對側(cè)前爪伸縮困難為1分；行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；站立不穩(wěn)，行走時向偏癱側(cè)傾倒為3分；意識喪失，不能自行行走記為4分。造模完成后，運用水迷宮測試模型鼠的逃避潛伏期，然后，與造模型前做比較，神經(jīng)行為學(xué)評分為1～3分，并且逃避潛伏期延長≥35 s，即為造模成功。

關(guān)于VD模型評估研究，有研究者以實驗組大鼠和對照組大鼠的潛伏期比值做比較，來評價模型成功與否。具體方法為：統(tǒng)計對照組大鼠逃避潛伏期，并作為參考值，并記錄實驗組大鼠造模后的逃避潛伏期，計算其和參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比例，該比值大于20%定為癡呆鼠，若20%<比值≤30%為輕度癡呆，該30%<比值≤40%為中度癡呆，該比值>40%為重度癡呆[30-31]。

5 認知功能障礙的評定方法

VD主要表現(xiàn)為認知功能障礙，實驗研究中通常將學(xué)習(xí)、記憶、辨識作為檢測指標，因此而出現(xiàn)的檢測方法主要包括Morris水迷宮實驗測試方法，新物體識別實驗方法，被動回避任務(wù)實驗方法，跳臺法實驗方法等，根據(jù)研究所需選擇適宜的測試評定方法，目前，Morris水迷宮實驗最為廣泛使用[32-38]。

6 小結(jié)

“癡呆”一詞最早出現(xiàn)在《華佗神醫(yī)秘傳·華佗治癡呆神方》?！鹅`樞·海論》曰：“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒……”對癡呆有記載和認識。近年來，中醫(yī)藥關(guān)于在VD的研究取得很大的成果。根據(jù)VD形成的病理、病機特征，以及人類腦部血管的解剖特點，目前，在中醫(yī)、西醫(yī)的動物實驗多選大鼠作為研究對象，模型選用為文中所述的VD模型[39-40]。然而，在模型應(yīng)用中，部分研究往往會缺少一些重要環(huán)節(jié)，這些容易忽視的步驟包括：①在造模前，運用Morris水迷宮對實驗動物進行測試和篩選，最終剔除游泳障礙、體質(zhì)比較弱，以及測試成績不符合本次研究標準的大鼠；②造模后對模型大鼠進行測評和篩選，根據(jù)神經(jīng)行為學(xué)評分，逃避潛伏期時間是否延長，或是與對照組參考值之差之間的比值，判定模型是否成功。

關(guān)于VD模型的制備，張浩浩等[41]研究表明同時結(jié)扎雙側(cè)CCA，死亡率達45%，王錦錦等[42]研究結(jié)果顯示死亡率為30%。在這些研究中也選擇分階段結(jié)扎兩側(cè)CCA作為對照研究，即第一次結(jié)扎左側(cè)CCA，間隔5 d后結(jié)扎右側(cè)CCA，以達到降低死亡率目的。筆者在運用針灸治療VD的研究中采用了同時結(jié)扎雙側(cè)CCA，造模36只，死亡4只，死亡率為11%。經(jīng)過與所收集的文獻研究對比，該造模死亡率明顯低于已有的研究報道。對于同時結(jié)扎雙側(cè)CCA的造模方法，筆者近期的研究中，死亡4只的大鼠中有3只是早上造的模型，其可能原因是早上造模大鼠獲得的休息時間較少，沒有處于更好的狀態(tài)，因此，研究者在造模過程中可考慮時間點的選擇，以降低實驗動物死亡率。

中醫(yī)藥的研究中，“治未病”理念下的早期醫(yī)療手段干預(yù)在針灸的研究中取得顯著的研究成果[43-44]，VD的研究也不例外，雙側(cè)同時結(jié)扎CCA，有利于后期針灸或者其他中醫(yī)藥干預(yù)方法的早期介入治療，針刺早期干預(yù)，有助于VD的改善，早期干預(yù)治療疾病也被廣泛應(yīng)用于動物實驗和臨床試驗研究。同時，中、西醫(yī)在VD的動物實驗研究中，也要考慮到模型動物的選擇，造模前動物的篩選，選用成熟的方法造模，以及造模完成后鑒定模型是否成功，最后進行實驗結(jié)果評定，只有做好研究中的每一個環(huán)節(jié)，方能確保實驗順利而有序進行，最終得到可靠的實驗結(jié)果。