張 黎 綜述，周 梅 審校

(重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，重慶 401120)

快速現(xiàn)場評價(ROSE)是一種在穿刺、活檢、刷片等方法收集標本時，相關人員在場，對所得標本滿意度進行快速評價、得出初步診斷和優(yōu)先策略，反饋指導下一步操作的技術。ROSE可用于多學科，在診斷性介入肺臟病學操作中，ROSE 是一項實時伴隨于取材過程的快速細胞學判讀技術。靶部位取材時，在基本不損失組織標本的前提下，將部分取材印涂于玻片，制成細胞學片基，迅速染色并以專用顯微鏡綜合臨床信息立即判讀。作為一種細胞學載體，ROSE具備相應功能，包括評價取材滿意度、實時指導介入操作手段與方式、形成初步診斷或縮窄鑒別診斷范圍、優(yōu)化靶部位標本進一步處理方案、結合全部臨床信息與細胞學背景進行病情分析與轉歸預判[1]。但ROSE的應用是否有益仍存在爭議，仍需進一步研究以獲取最佳的方法及標準，故本文擬將最新的ROSE在診斷性介入肺臟病學的應用進展展開綜述。

1 ROSE的細胞學評判進展及操作者的選擇

ROSE是一個簡單而復雜的程序，具體的操作可以分為3個步驟:生產、染色、讀片解釋。由于ROSE的目的是實時指導干預過程，其技術核心有兩點:一是盡可能提高膜片的制作和染色速度；二是準確解釋細胞學結果。因此，可能影響主要結果的ROSE處理信息包括如涂片方法、涂片技師的水平、染色方法、染色技師的水平、有創(chuàng)程序、讀片技師的職業(yè)等[2]。

在涂片方法上包括:印片(滾片)、刷片(涂片)、噴片、留片[1]；在染色方法上，可采用迪夫染色、甲苯胺藍染色、劉氏染色等，均可在1 min內完成染色內容[3]，WHO 推薦采用迪夫染液對 ROSE 細胞學片基進行快速染色[1]。迪夫染色與瑞氏染色類似，經技術改良而成，結果也和瑞氏染色類似。迪夫染色耗時很短，僅30～70 s。因為制片、染色耗時極短，使 ROSE 判讀過程幾乎與介入操作過程形成“實時”反饋。染色時推薦采用“浸染”而非“滴染”以提高染色質量與效率[4-5]。

如何判斷涂片的質量？有學者研究了如何判斷ROSE樣本是否充足的簡單算法，2位病理學家分別對133例患者300個淋巴結行超聲內鏡引導下經支氣管針吸活檢(EBUS-TNBA)的ROSE涂片進行回顧，并將其結果與最終病理結果進行比較，發(fā)現(xiàn)采用組織核心大小(組織核心大于或等于2 cm)、有無惡性細胞、可見炭疽色素(MAP)和淋巴細胞密度增加(LD)≥40個細胞/蘇木精-伊紅(HP,40×)，敏感性和準確率分別從64.4%提高至98.6%和64.7%提高至97.3%[6]。有研究通過對不同細胞形態(tài)參數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)對于腺癌，核仁和小/中細胞團簇的結合具有最佳的敏感性和特異性，對于鱗狀細胞癌，壞死大于或等于50%和大細胞團簇的結合具有最佳的敏感性和特異性。對于小細胞癌，中度壞死(50%)和單細胞存在的診斷準確率最高；總體精確度在90%～97%。該研究表明，僅使用幾個容易識別的細胞形態(tài)學參數(shù)就可以建立ROSE期間最常見肺癌的組織類型。在ROSE中一個準確的診斷可以幫助內鏡醫(yī)師決定需要取多少腫瘤樣本，例如腺癌的生物分子特征需要更多的樣本，而鱗狀細胞癌一個樣本就足夠了[7]。對于如何更好地判斷ROSE涂片的制作及病理學方法，研究尚不多，有待進一步研究。

通常情況下，細胞學ROSE評估應由專業(yè)的病理科醫(yī)師操作，或現(xiàn)場制片將鏡下觀察圖像通過遠程系統(tǒng)將數(shù)據(jù)傳輸至病理科醫(yī)師實時評估[7-8]。但由于條件限制，很多呼吸內鏡中心缺乏專門的病理科醫(yī)師，從而限制了ROSE的發(fā)展，是否有替代方案？BONIFAZI等[9]報告，經過3個月的細胞病理學培訓后，呼吸科醫(yī)生和細胞病理學家對ROSE的評估達成了81%的總體一致。來自日本的一項研究提示，ROSE由1名呼吸科醫(yī)生完成，而該醫(yī)生在1位細胞技術專家的培訓下總共工作了1個月，將ROSE的結果與細胞病理學家最終診斷結果進行比較，結果在所有操作中，ROSE的靈敏度為88.5%，特異性為83.0%，診斷準確率為86.4%，提示經過訓練的肺科醫(yī)生通過ROSE對肺癌的判斷非常高，與病理學家的結論無明顯差異[10]。NATALI等[11]的研究結果也顯示，經過專業(yè)訓練的呼吸科醫(yī)生可以可靠地評估支氣管鏡下ROSE涂片的腫瘤負荷，特別是在評價淋巴結疾病時，這對于那些沒有定期提供細胞病理學家的機構尤其有用。另一項研究也顯示，醫(yī)學專家對ROSE的判斷與病理學家無顯著差異，是一個可接受的選擇[12]。另外，與細胞病理學家的最終評估相比，由生物醫(yī)學科學家進行的ROSE和初步充分性評估及初步診斷都具有高度的準確性[13]。上述研究提示，在ROSE過程中，對呼吸內鏡醫(yī)生或呼吸科醫(yī)生進行培訓后可以到達與病理科醫(yī)師類似的評估水平，特別是對腫瘤性疾病，對一些良性疾病的判別仍存在困難。但培訓的內容、時間等是否有標準化的參考仍缺乏研究。

2 ROSE在氣管鏡中的應用

2.1ROSE在常規(guī)經支氣管鏡針吸活檢(c-TBNA)和EBUS-TBNA中的應用 c-TBNA和EBUS-TBNA是診斷性介入肺臟病學中的常見操作，也是呼吸科中ROSE 應用最廣泛的領域。MALLYA等[14]研究表明，以組織病理學檢查為“金標準”，EBUS-TNBA聯(lián)合ROSE診斷的總體敏感性和特異性分別為85.4%和89.6%，單純惡性腫瘤的敏感性和特異性分別為100.0%和98.4%，從而認為這種新方法安全性高、診斷率高，在輔助介入支氣管鏡安全、準確診斷方面具有很好的潛力，ROSE促進樣本充足，也有助于快速臨床決策。另一項236例患者EBUS-TBNA的研究顯示，ROSE組的病理分層診斷率明顯高于非ROSE組(90.5%vs.81.2%，P=0.003)，當對肺癌患者肺門或縱隔淋巴結進行取樣時，可疑結果的發(fā)生率較低，因此提高了病理學分層診斷的診斷率[15]。專家和科學協(xié)會指南建議使用ROSE和EBUS-TBNA優(yōu)化肺癌基因分型，但尚未開展比較試驗來確認和量化其有效性，TRISOLINI等[16]的研究結果顯示，ROSE防止了對至少1/10的晚期肺癌患者進行分子譜分析的重復侵入性診斷程序的需要，并且顯著降低了提取樣本的風險。不僅僅是腫瘤性疾病，在許多非腫瘤疾病中，ROSE也顯示出了積極的作用。關于一項EBUS-TNBA用于肉芽腫性疾病淋巴結取樣進一步ROSE的研究表明，ROSE與最終的細胞學診斷有很高的一致性，且ROSE可以縮短手術時間，加強樣本篩選，并消除進一步侵入性檢查的需要，唯一與一致性增加相關的變量是操作者的經驗[17]。另一項對80例疑似結節(jié)病的患者的隨機對照研究顯示，當對疑似結節(jié)病進行TBNA時，c-TBNA伴ROSE和EBUS-TBNA(伴ROSE或不伴ROSE)優(yōu)于單獨的c-TBNA，但c-TBNA伴ROSE是否可以等同于EBUS-TBNA，由于樣本量不多，這項研究尚無法確定，有待進一步大樣本的研究[18]。在沒有EBUS的中心，與單一c-TBNA相比，同時與ROSE聯(lián)合使用的TBNA產生的適宜樣本比例增加，可以縮短手術時間，增強樣本篩選，從而限制進一步侵入性診斷檢查的需要[19]。帶ROSE的c-TBNA是一種安全、有效、經濟的支氣管鏡檢查方式，當操作員常規(guī)執(zhí)行帶ROSE的c-TBNA時，可以獲得與EBUS-TBNA相似的診斷產量，即使在有EBUS設施的中心，c-TBNA也應該常規(guī)進行[20]。提示ROSE在c-TNBA中的收益可能大于在EBUS-TNBA中的收益。

然而，一篇meta分析薈萃了5項研究后認為雖然在EBUS-TBNA期間，使用ROSE與針吸的次數(shù)較少以及在TBNA期間進行額外支氣管鏡檢查以作出最終診斷的總體需求較低相關，在c-TNBA中使用ROSE可以縮短并發(fā)癥的發(fā)生(但在EBUS-TNBA時沒有發(fā)揮該作用)，但是使用ROSE既不能提高TBNA的診斷率，又不能減少手術時間，該研究認為雖然ROSE是否用于所有TNBA患者還有爭議，但可以用于高危患者，比如多重疾病患者以減少氣管鏡的程序[21]。在另一前瞻性研究中，348例EBUS-TBNA手術中，有213例使用ROSE進行，診斷的準確率從84.4%提高至90.6%，但P=0.082，且在多變量模型中進行調整后，ROSE的益處仍未達到統(tǒng)計學差異顯著性。在惡性疾病或結節(jié)病的亞組患者中也得到了類似的結果。病變的大小并不影響ROSE對準確性的影響，該項研究表明ROSE與EBUS-TBNA準確性的適度提高相關，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[8]。

ROSE在TNBA中的作用是否重要，仍然存在爭議，就現(xiàn)有研究來看，在c-TNNA中的優(yōu)勢大于EUBS-TNBA中的優(yōu)勢，這可能是由于EBUS-TBNA本身已具有較高的診斷率。另外，ROSE的作用與呼吸內鏡中心操作者的經驗有較大關系，故有待設計更嚴謹?shù)碾S機對照試驗，更多中心、大樣本的試驗來消除偏倚，進一步明確ROSE的意義所在。

2.2ROSE在新的肺臟疾病診斷性介入操作中的應用 徑向探針支氣管內超聲(R-EBUS)近年來已成為經支氣管活檢(TBB)診斷肺周圍病變(PPLs)的有力工具，提高了診斷率，影響支氣管內超聲引導下TBB診斷率的因素通常是探針的位置，病灶的大小、位置，PPLs的CT掃描外觀和支氣管鏡醫(yī)生的經驗。來自臺灣的一項研究提示，ROSE可以提高R-EBUS對PPLs的診斷率，特別是對診斷困難的PPLs:病灶直徑小于3 cm，支氣管征象陰性，位于右肺尖和左肺尖后段，探頭靠近處伴有胸腔積液的PPLs。在這項研究中，R-EBUS聯(lián)合ROSE具有較高的診斷效果，診斷率在53%～94%。ROSE提高了所有相關專家的診斷能力，特別是難以觸及的具有挑戰(zhàn)性的病例，操作者可以根據(jù)ROSE結果改變穿刺部位、穿刺深度或穿刺角度。R-EBUS引導下的TBB沒有實時超聲引導下的采樣，使用R-EBUS引導下TBB鉗采集的標本比EBUS-TBNA采集的標本大，且使用ROSE后可降低支氣管肺泡灌洗(BAL)的比例，避免額外的診斷程序，降低支氣管鏡的并發(fā)癥發(fā)生率而不損失診斷率。盡管BAL等額外診斷程序的比例降低了，但ROSE組并不能縮短支氣管鏡檢查時間，因為ROSE的涂片準備和復查需要時間[22]。另一項R-EBUS聯(lián)合ROSE的研究也提示，ROSE可提高診斷率，縮短手術時間，且未觀察到嚴重的手術相關并發(fā)癥，如氣胸和出血，R-EBUS聯(lián)合ROSE是診斷肺周圍病變是一種安全有效的方法[23]。

目前，氣管鏡對PPLs的診斷率仍然不足，為了提高氣管鏡的診出率，一項納入了45例患者的研究聯(lián)合支氣管超聲(EBUS)、虛擬支氣管鏡導航(VBN)和ROSE等技術，提示聯(lián)合使用這些技術可能有助于肺癌的診斷[24]。電磁導航支氣管鏡(ENB)常常和R-EBUS聯(lián)合使用，是用于周圍型肺部病灶診斷的新興技術，一項國內最新研究顯示，電磁導航支氣管鏡活檢聯(lián)合 ROSE 更適用于肺外周型孤立性結節(jié)的診斷[25]。全肺實時診療導航(Lung-Pro)支氣管鏡技術是通過對患者薄層高分辨率CT數(shù)據(jù)進行三維重建，再結合虛擬支氣管鏡技術，深入到達12～14級支氣管結節(jié)部位，實現(xiàn)肺部病灶的實時導航和精確定位，一項國內的研究表明，Lung-Pro導航可精確抵達病灶取得病理組織，有較高的診斷率，且有導航及手術時間短、安全、并發(fā)癥少等優(yōu)點，與ROSE結合可提高取樣質量，減少活檢、穿刺次數(shù)，從而減少并發(fā)癥發(fā)生[26]。

PPLs的診斷一直是臨床的挑戰(zhàn)，機器人輔助的支氣管鏡平臺已經被開發(fā)出來，有可能提高PPLs的診斷率。一項前瞻性、多中心試點的研究，在PPLs 1～5 cm大小的患者中使用了一種機器人支氣管鏡系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有母女配置。主要終點是利用R-EBUS成像成功定位病變和觀察手術相關不良事件的發(fā)生率，所有病例均采用ROSE，ROSE確診時僅經支氣管針吸即可；當ROSE不能診斷時，使用機器人平臺進行經支氣管活檢，然后由研究者自行決定常規(guī)引導的支氣管鏡入路。54例中有53例有R-EBUS影像。53例患者中51例(96.2%)病灶定位成功。這是首個對PPLs患者進行機器人支氣管鏡檢查的前瞻性、多中心研究。96.2%的病例成功進行了病灶定位，不良事件發(fā)生率與傳統(tǒng)的支氣管鏡手術相當[27]。

上述研究提示，對于取材較困難的肺外周性病變，在使用各種介入肺臟病學臨床檢查取材時聯(lián)合使用ROSE，可以提高診斷率、減少操作流程，但仍需更多的大樣本研究。

3 結合其他方法的ROSE

傳統(tǒng)意義上的ROSE是一種細胞學診斷方法，然而，到目前為止，還沒有建立在氣管鏡檢查中對TBB標本進行快速現(xiàn)場組織病理學診斷的方法。有研究顯示了未來組織病理學現(xiàn)場評價開發(fā)的價值，基于探針的共聚焦激光顯微內鏡(pCLE)是一種新穎的、無創(chuàng)的技術，在支氣管鏡檢查中提供實時肺成像，采用吖叮黃對TBB標本進行染色，利用pCLE對離體標本進行良惡性結構評估，根據(jù)細胞密度和核大小差異對良惡性病變進行分類，并確定是否可以通過pCLE對TBB標本進行快速的組織病理學診斷。對36例標本研究后顯示對惡性腫瘤的敏感性為91.3%，特異性為76.9%。因此認為pCLE可以作為一種工具在支氣管鏡檢查中用于快速的組織病理學現(xiàn)場診斷[28]。

快速現(xiàn)場診斷對早期肺癌是非常必要的，有學者研究了一種新的診斷照明納米技術，他們通過EBUS-TBNA、常規(guī)氣管鏡等獲取的淋巴結、癌組織和異常肺內病變中提取組織標本，制備了30例患者的30份組織標本，隨后將CytoViva?照明納米技術應用于每個活檢組織切片。細胞viva軟件一旦為每個實體組織創(chuàng)建了特定的光譜庫，就能夠在隨后的成對的同一疾病的幻燈片中再次識別出同一疾病。對該技術的進一步評價可以使這種照明納米技術成為一種有效的快速現(xiàn)場診斷工具。DARWI-CHE等[29]目前已經制作了一種探針，可以通過支氣管鏡的工作通道插入，其能夠創(chuàng)建探針接觸到的任何組織的光譜庫，而不需要進行組織取樣和準備檢查的載玻片，然而還需大量的臨床試驗以檢測該技術的優(yōu)缺點。

一項國內的研究探討應用xTAG70plex液相芯片技術對非小細胞肺癌(NSCLC)患者的ROSE細胞學制片進行EGFR、KRAS和PIK3CA基因檢測的可行性及其臨床價值，結果顯示除1例在組織學標本檢出為KRAS突變而在配對的 ROSE細胞學標本沒有檢測出來的病例外，其他病例基因突變檢測結果均相同，2種標本EGFR基因突變檢測結果一致率為100%，KRAS基因突變檢測結果一致率為98.7%。提示xTAG70plex液相芯片技術可以有效地檢測ROSE 細胞學制片EGFR、KRAS和PIK3CA的基因突變狀態(tài)，對于NSCLC患者，ROSE細胞學制片可以作為組織學替代標本進行基因檢測[30]。

上述最新的研究提示ROSE發(fā)展的新方向不僅僅是限于細胞學的現(xiàn)場診斷及評估，還應該向現(xiàn)場組織病理學、更具分辨性的光譜分析、基因分析等方向發(fā)展。

4 結語與展望

ROSE作為一種以細胞學為背景的快速現(xiàn)場評價，在診斷性介入肺臟病學中已經得到廣泛應用，雖然存在爭議，但對所得標本滿意度進行快速評價、得出初步診斷和優(yōu)先策略方面的優(yōu)勢是有目共睹的。如何更好地應用ROSE，規(guī)范的取材、印染、讀片技術都很關鍵，未來希望有更嚴謹?shù)难芯恳詭椭贫ǜ敿毜闹改弦?guī)范上述操作過程。ROSE應用于c-TBNA的優(yōu)勢較EBUS-TNBA更明顯，這可能是由于EBUS-TBNA本身已具有較高的診斷率。對于取材較困難的肺外周性病變，ROSE聯(lián)合R-EBUS、VBN、ENB、Lung-Pro、機器人輔助的支氣管鏡平臺等新的診斷學介入方法的優(yōu)勢更為明顯。另外，ROSE發(fā)展的新方向不僅僅是限于細胞學的現(xiàn)場診斷及評估，還應向現(xiàn)場組織病理學、更具分辨性的光譜分析、基因分析等各方向發(fā)展，以豐富診斷方法，提高肺部疾病診斷率。ROSE是一項簡單有復雜的技術，存在更多可能性，值得開展更多深入及拓展性的研究。