曲麗靜，賈海洋

（1.榮成市石島管理區(qū)王連畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264309；2.榮成市石島管理區(qū)東山畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264311）

當(dāng)前隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，畜牧業(yè)產(chǎn)值在地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)值比重逐漸增加，也成為我國國民經(jīng)濟(jì)重要發(fā)展戰(zhàn)略之一?；蚬こ碳夹g(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)中發(fā)揮重要作用，基于此，本文通過分析基因工程技術(shù)，并闡述該技術(shù)在地方畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域中的重要性。尤其針對基因敲除技術(shù)進(jìn)行分析，該技術(shù)是繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)在分子生物領(lǐng)域中的又一次技術(shù)革命，能夠克服隨機(jī)整合盲目性以及偶然性，是理想改造生物遺傳物質(zhì)的重要方法。

1 基因工程技術(shù)

1.1 生物技術(shù)類型生物技術(shù)目前被用于細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等多個方面，可用于生命系統(tǒng)研究、設(shè)計、改造，甚至創(chuàng)造新生命，或運(yùn)用工程學(xué)和生物體系實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品生產(chǎn)和服務(wù)提供的新型技術(shù)。根據(jù)研究方法和研究對象，可將現(xiàn)代生物技術(shù)分為發(fā)酵基因，蛋白質(zhì)酶以及細(xì)胞工程等，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，可將生物技術(shù)分為環(huán)境，生物技術(shù)，食品生物技術(shù)，植物、動物生物技術(shù)等。從整體上來看，現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種新興技術(shù)與其他技術(shù)有必然聯(lián)系，但也存在明顯區(qū)別，其中基于DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)是目前現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，對于其他技術(shù)整體發(fā)展來說具有十分重要的意義，能夠影響其他生物領(lǐng)域。生物技術(shù)是21世紀(jì)的高新技術(shù)核心，未來生物技術(shù)也將成為支柱產(chǎn)業(yè)，隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展，各國家將生物基礎(chǔ)作為強(qiáng)化國家經(jīng)濟(jì)實(shí)力的重要技術(shù)，并投入大量人力、資金。

1.2 基因工程基因工程是指通過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品生產(chǎn)改造的關(guān)鍵技術(shù)，能將人工合成基因或外源基因與載體DNA重組，并將該重組的DNA轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因生物或相應(yīng)產(chǎn)品。在現(xiàn)代生物技術(shù)中基因工程技術(shù)是基礎(chǔ)技術(shù)，其他技術(shù)在發(fā)展過程中需基于生物基因工程技術(shù)。在整個生物產(chǎn)業(yè)中基因工程是上游技術(shù)，其特點(diǎn)是以核酸作為操作對象，在不同體系中進(jìn)行目標(biāo)表達(dá)，獲得不同產(chǎn)物?；蚬こ叹邆涠鄠€表達(dá)體系，包括真核、原核、植物、動物個體等，不同表達(dá)體系應(yīng)用不同。原核生物具有簡單的表達(dá)體系，其表達(dá)效率高，應(yīng)用范圍廣，然而大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物不具有生物活性。個體重組蛋白具有良好生物活性，但該體系表達(dá)水平較低且制作成本高，因此針對不同生產(chǎn)目標(biāo)可以選擇合適的表達(dá)體系，比如生產(chǎn)良好生物活性醫(yī)藥蛋白以動物乳腺為表達(dá)體系，比如動物生物反應(yīng)器。為獲得安全實(shí)用的畜禽基因工程疫苗，應(yīng)采用原核微生物進(jìn)行表達(dá)，要想生產(chǎn)動物飼料酶制劑，應(yīng)選擇酵母表達(dá)體系。

2 在畜牧獸醫(yī)中基因工程技術(shù)的具體應(yīng)用

通過對不同體系進(jìn)行合理選擇，可將基因工程技術(shù)廣泛用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來研發(fā)動物乳腺生物反應(yīng)器，以使企業(yè)生產(chǎn)具有良好市場發(fā)展前景的醫(yī)藥蛋白，并實(shí)現(xiàn)畜牧品種選育，提升動物生產(chǎn)性能。在開發(fā)基因工程疫苗以及研發(fā)相應(yīng)生物產(chǎn)品技術(shù)時，可借助原核表達(dá)體系，該技術(shù)涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，動物遺傳育種等不同學(xué)科。

2.1 動物生物反應(yīng)器基因工程技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域中主要是利用動物生物反應(yīng)器來研發(fā)生物醫(yī)藥蛋白，該動物生物反應(yīng)器應(yīng)用較廣，目前多個國家在這一方面投入大量的人力、物力，比如組織纖溶酶原，激活劑等生物反應(yīng)器，可用于表達(dá)醫(yī)藥蛋白等。國內(nèi)多次進(jìn)行人乳鐵蛋白產(chǎn)品的研發(fā)，通過轉(zhuǎn)基因動物能夠獲得濃度高達(dá)10g/L，相比現(xiàn)有商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)來說，人乳鐵蛋白表達(dá)水平明顯較高。

2.2 基因工程育種研究表明在畜牧業(yè)發(fā)展過程中畜禽良種培育和快速擴(kuò)繁是其重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)畜禽培育中需通過動物表達(dá)來獲取關(guān)鍵的遺傳標(biāo)記信號，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)新品種選育，在遺傳標(biāo)記選擇中其流程相對復(fù)雜，并且畜禽生長周期長，易導(dǎo)致培育過程花費(fèi)時間長，成本大，隨工程基因組學(xué)研究，其對畜禽經(jīng)濟(jì)性狀、分子機(jī)理進(jìn)行深入探究，使研究學(xué)者能夠通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)綜合基因組學(xué)，從分子細(xì)胞水平進(jìn)行遺傳性狀的修改，以縮短世代間隔，更好的提升動物育種進(jìn)程。

2.3 基因工程疫苗在生產(chǎn)基因工程疫苗時可借助基因工程技術(shù)，以應(yīng)對國內(nèi)外面臨的重大動物疾病，比如禽流感，一般是人畜共患病，不僅影響地方畜牧業(yè)發(fā)展，同時還會從一定程度上制約人身安全。為能夠有效防止動物疫病在全球范圍內(nèi)傳播，需提升動物免疫效果，以減少動物發(fā)病的機(jī)會，現(xiàn)有動物疫苗采用的是弱毒苗或滅活苗，其安全性不樂觀，采用基因工程疫苗能夠補(bǔ)充這一缺陷，該疫苗具有良好的安全性，成本低，免疫效果佳，使用快捷等。

2.4 飼料用酶制劑在動物營養(yǎng)和飼料加工中，也可以用基因工程技術(shù)，比如利用酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。酶制劑是從微生物，動物，植物等體內(nèi)提取且具備一定酶活性的生物活性物質(zhì)，其是與少量載體混合制備成粉劑。一般蛋白酶，乳糖酶，果膠酶，纖維素酶等可作為基因工程技術(shù)的酶源。飼用酶制劑能夠通過基因工程技術(shù)消除飼料中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及有害物質(zhì)，幫助植物細(xì)胞壁破壞促進(jìn)養(yǎng)分吸收，以更好的促進(jìn)畜禽動物生長，減少養(yǎng)殖業(yè)的廢氣廢物排放。

2.5 其他基因工程產(chǎn)品除上述之外，基因工程技術(shù)還可用于畜禽生長激素釋放因子等不同，蛋白的生產(chǎn)以更好調(diào)控畜禽動物的生長發(fā)育情況。通過研發(fā)瘤胃微生物以進(jìn)一步提升飼料轉(zhuǎn)化率，為更好的分析動物活動規(guī)律，可制作基因缺失動物模型。總之，基因工程技術(shù)可廣泛用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，以改善畜禽生產(chǎn)性能，擴(kuò)大蛋白質(zhì)飼料的來源，提升飼料營養(yǎng)成分和利用率，更好的解決地方資料不足的問題，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，這對于有效控制和預(yù)防動物疾病，傳播改善外界環(huán)境具有重要意義。

3 基因敲除

上世紀(jì)80年代研究所提出基因敲除技術(shù)，該技術(shù)是一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過同源重組，能夠?qū)⑼庠椿蚨c(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組中的某一確定位點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾、改造染色體基因的目的，可在細(xì)胞或動物個體水平進(jìn)行基因功能的觀察。同時，目前研究學(xué)者提出的胚胎干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)，這些技術(shù)也能夠?yàn)榛蚯贸於ㄖ匾A(chǔ)。

3.1 基因敲除的步驟（1）構(gòu)建基因敲除載體；（2）將經(jīng)銷處載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞；（3）篩選陽性胚胎干細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎，將重組胚胎倒入假孕母體中，使其直接發(fā)育為個體；（4）將基因敲除動物進(jìn)行交配，獲得純合體進(jìn)行敲除動物。基因敲除是一種基因組學(xué)編輯技術(shù)，可用于醫(yī)學(xué)研究生物領(lǐng)域中，之后可逐漸用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域。近年來常使用的基因敲除包括鋅指核酶技術(shù)，RNA干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)子技術(shù)等，相比同源重組來說能夠顯著提升打靶效率，為后續(xù)節(jié)約篩選時間，由細(xì)菌到哺乳動物均具有較高基因編輯活性。

3.2 基因敲除技術(shù)當(dāng)前在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域中廣泛利用基因敲除技術(shù)，包括構(gòu)建動物模型，進(jìn)行藥理學(xué)研究，免疫學(xué)分析，動物疾病治療預(yù)防，病原微生物致病機(jī)理研究，轉(zhuǎn)基因動物研究等。具體來看，（1）構(gòu)建動物模型。上世紀(jì)80年代全球完成首例小鼠基因打靶實(shí)驗(yàn)，當(dāng)前基因敲除在動物模型構(gòu)建方面獲得快速發(fā)展，并廣泛用于人、小鼠、雞、牛、羊等物種中。比如由Hu等人提出將小鼠卡巴B蛋白抑制因子激酶1基因敲除，用于基因功能分析，通過研究發(fā)現(xiàn)，IKK1+/-個體表型相對正常，但I(xiàn)KK1-/-個體存在四肢突出，頭低于正常值的小鼠?；蚯贸夹g(shù)用于動模型研究方面，目前主要研究方向?yàn)樾∈笈咛ジ杉?xì)胞基因打靶，基于此，所構(gòu)建的動模型是與人類遺傳病具有一定聯(lián)系。比如由Incerti進(jìn)行小組OAI基因敲除，通過眼科研究發(fā)現(xiàn)小鼠眼球底部黑色素不足，是與人臨床表現(xiàn)類似的，可用于眼白化病一型發(fā)病機(jī)制的研究。（2）藥理學(xué)研究，利用小鼠模型能夠給動物疾病研究提供重要基礎(chǔ)，基因敲除技術(shù)可用于揭示疾病機(jī)理，尋找臨床治療靶點(diǎn)。由ZAhang等人利用CRISP/Cas基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新型抑制弓形蟲生長藥物靶點(diǎn)。金屬硫蛋白是細(xì)胞內(nèi)含半胱氨酸巰基小分子蛋白，由Vasak等人通過基因敲除技術(shù)敲除小鼠中金屬硫蛋白基因，通過研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因敲除的小鼠相比對照來說，對多環(huán)酚烴化物二甲苯胺皮膚癌毒性較為敏感。阿片類受體是以阿片物質(zhì)作為直接受體，在鎮(zhèn)痛中阿片類藥物能夠起到良好的效果，其受體包括K、u等。（3）免疫學(xué)研究，在機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答和免疫功能中免疫系統(tǒng)作為重要系統(tǒng)，是有效預(yù)防病原體入侵，保障內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理系統(tǒng)，很多免疫系統(tǒng)疾病可從基因水平進(jìn)行分析。比如Totey等人敲除小鼠TCR基因，通過實(shí)驗(yàn)研究表明小鼠胸腺結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全，顯著增加脾β細(xì)胞，在敲除免疫球蛋白u(yù)鏈之后，研究結(jié)果表明β細(xì)胞在發(fā)育過程中受阻。（4）動物疾病預(yù)防及治療，基因敲除技術(shù)也可用于動物疾病的預(yù)防和治療，比如由Xia等人利用人工設(shè)計微RNA從細(xì)胞水平進(jìn)行PRRSV復(fù)制抑制，由Guo利用miRNA-181在細(xì)胞中抑制PRRSV復(fù)制，同時利用miRNA-181相似物，可緩解患病個體臨床癥狀。朊病毒是導(dǎo)致瘋牛病的重要致病因子，Bueler等人敲除小鼠中阮病毒基因后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠不會感染阮病毒，同時無其他副作用。Sutou等人對牛阮病毒基因進(jìn)行小分子干擾敲除后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19號、21 NT的siRNA具有較高抑制率。當(dāng)前在動脈粥樣硬化研究中應(yīng)用較多的基因工程，動物是載脂蛋白E基因敲除小鼠，研究學(xué)者利用這種動物模型敲除小鼠大量持續(xù)注射內(nèi)抑素全組蛋白，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)抑素全組蛋白能夠抑制載脂蛋白1基因敲除小鼠中動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展。（5）轉(zhuǎn)基因動物研究。轉(zhuǎn)基因動物主要是指將外源基因通過轉(zhuǎn)讓方式導(dǎo)入動物受體中，進(jìn)而形成在動物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的外源基因動物。將人源基因轉(zhuǎn)移至動物體內(nèi)，直接形成轉(zhuǎn)基因動物，進(jìn)而能夠?yàn)槿祟惿a(chǎn)低成本的生物制品。比如人血清白蛋白，可用于創(chuàng)傷、燒傷人群治療。由Jabed等人通過采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，能夠在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入羊的β乳球蛋白基因，進(jìn)而構(gòu)建小鼠模型，利用人工合成miRNA干擾羊的β乳球蛋白基因，通過研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組可生產(chǎn)并表達(dá)串聯(lián)miRNA的轉(zhuǎn)基因牛乳，但在轉(zhuǎn)基因植物中未檢測到羊的β乳球蛋白。

4 基因工程發(fā)展前景

在傳統(tǒng)畜牧獸醫(yī)行業(yè)中，通過借助基因工程技術(shù)其可實(shí)現(xiàn)多種產(chǎn)品技術(shù)的研發(fā)，包括飼料酶制劑或轉(zhuǎn)基因食品等。通過技術(shù)角度出發(fā)，這些基因工程技術(shù)研發(fā)產(chǎn)品具有良好市場發(fā)展前景，但消費(fèi)者的觀念也會從一定程度上影響市場發(fā)展前景。（1）轉(zhuǎn)基因食品由于受傳統(tǒng)倫理觀念的影響以及目前一些研究學(xué)者提出反對轉(zhuǎn)基因的問題，基于市場競爭激烈的前提下，我國在綜合保護(hù)本國傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)角度出發(fā)，針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品銷售問題提出相對嚴(yán)格的措施。對此，應(yīng)正確認(rèn)識基因工程技術(shù)，其作為一種新型生物技術(shù)，在制定轉(zhuǎn)基因生物政策法規(guī)時要求提高理性，比如農(nóng)業(yè)部發(fā)放農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書，更好的促進(jìn)地方農(nóng)業(yè)技術(shù)以及產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)性發(fā)展，同時也能夠有效規(guī)范轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口秩序，（2）針對基因工程技術(shù)及產(chǎn)品，一些消費(fèi)者存在誤區(qū)，因此制定政策措施會誤導(dǎo)消費(fèi)者，甚至使其對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品產(chǎn)生抵抗，錯誤的認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品不可食用，無法認(rèn)可和接受這種轉(zhuǎn)基因食品。隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展，人們不斷了解和改進(jìn)經(jīng)營工程技術(shù)，也認(rèn)識到在多個領(lǐng)域中將會嚴(yán)格檢驗(yàn)基因工程技術(shù)及產(chǎn)品，其能夠?yàn)榻鉀Q人口增加引發(fā)的食品短缺問題提供幫助，因此需要在市場上廣泛為消費(fèi)者普及生物學(xué)常識，以消除消費(fèi)者的傳統(tǒng)錯誤認(rèn)知，尤其是關(guān)于基因工程的理論知識。針對基因工程產(chǎn)品，包括基因工程疫苗，酶制劑，醫(yī)藥蛋白等未涉及食品安全問題，對這種基因工程產(chǎn)品市場較為樂觀，消費(fèi)者應(yīng)于接受。當(dāng)前部分基因工程疫苗，酶制劑獲得廣泛推廣應(yīng)用，以形成較大規(guī)模產(chǎn)業(yè)鏈，能夠更好的促進(jìn)地方畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域發(fā)展。

5 小結(jié)

動物基因工程技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，其在促進(jìn)地方畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域發(fā)展中發(fā)揮重要作用。利用基因工程技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)動物分子育種，基因工程疫苗，飼料抑制劑等研發(fā)。此外，在生物工程技術(shù)中，基因敲除技術(shù)作為其基礎(chǔ)技術(shù)，能夠從分子水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計，進(jìn)而推測基因?qū)W功能，該技術(shù)也可用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，包括動物模型構(gòu)建，藥理學(xué)研究，免疫學(xué)分析，動物疾病預(yù)防及治療，轉(zhuǎn)基因動物研究等。通過采用動基因工程技術(shù)，能夠從一定程度上促進(jìn)地方畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)整體技術(shù)升級，使其成為高技術(shù)含量，低成本高，附加值的現(xiàn)代化都市型畜牧業(yè)。