邱正青，李彥芳，邱國(guó)斌，陳朝陽(yáng)，屈勇剛

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆兵團(tuán)第四師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 可克達(dá)拉 835216）

豬偽狂犬?。≒seudorabies, PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的豬的一種急性、熱性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）納入必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，2022年被我國(guó)列為三類(lèi)動(dòng)物疫病。此病在世界范圍內(nèi)流行，隨著養(yǎng)豬業(yè)不斷發(fā)展，該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，我國(guó)采用凈化結(jié)合基因缺失苗免疫防控，使得該病的流行趨勢(shì)有所緩和，但該病的潛伏感染情況比較普遍，做好豬場(chǎng)PR血清學(xué)檢測(cè)，及時(shí)清除隱性帶毒豬，凈化豬群至關(guān)重要?？蒲泄ぷ髡邆兘⒘薖RV野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷方法，使用相應(yīng)的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測(cè)方法分別檢測(cè)PRV-gE蛋白和PRV-gB蛋白抗體來(lái)監(jiān)測(cè)豬群PRV野毒感染情況和疫苗免疫效果，大量試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了此方法具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏性強(qiáng)和特異性高等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

為了解新疆部分地區(qū)2021年豬群PRV野毒感染情況和疫苗免疫效果，本試驗(yàn)對(duì)來(lái)自新疆5個(gè)地區(qū)的9個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的580份血清樣品分別進(jìn)行了PRV-gE和PRV-gB抗體檢測(cè)及分析，以期為新疆地區(qū)的PR防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 血樣來(lái)源 2021年1—12月，從新疆石河子、阿克蘇、伊犁、克拉瑪依、烏魯木齊5個(gè)地區(qū)的9個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)隨機(jī)采集生豬血液，分離血清，共計(jì)采集580份血清樣品。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與材料 豬偽狂犬病病毒gB（PRV-gB）ELISA檢測(cè)試劑盒和豬偽狂犬病病毒gE（PRV-gE）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司；微量移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司、自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek儀器有限公司；一次性獸用采血器購(gòu)自廣州金默生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 對(duì)待檢豬只的前腔靜脈部位進(jìn)行消毒，使用一次性獸用采血器刺入前腔靜脈采集全血，3～5 mL/頭。室溫靜置2～3 h，待血清析出后，移至無(wú)菌EP管中，3 000 r/min離心10 min，立即進(jìn)行ELISA檢測(cè)，或放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法 根據(jù)PRV gB、gE蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。試驗(yàn)前，所有試劑需恢復(fù)至室溫，使用前輕微震蕩混勻。

室溫下，先用稀釋液將待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行2倍稀釋處理，再分別取100 μL稀釋好的待檢血清和陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照加入抗原包被板的微孔中，室溫孵育60 min；用洗滌液洗板3～5次后，拍干各孔殘留的洗滌液，每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育20 min；再次洗板3～5次，拍干后，每孔加入100 μL的TMB溶液，室溫避光顯色15 min后，加入50 μL終止液終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，測(cè)定各反應(yīng)孔中的OD650nm值，記錄并保存數(shù)據(jù)。

1.2.3 判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn) 判定本試驗(yàn)成立的條件是：NCX-PCX≥0.30，否則結(jié)果不成立。當(dāng)S/N＞0.70時(shí)，樣品判定為陰性；當(dāng)S/N≤0.60時(shí)，樣品判定為陽(yáng)性；當(dāng)0.6＜S/N≤0.70時(shí)，樣品判定為可疑。其中S為各樣品OD650nm值。其中，NCX、PCX分別為陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔OD650nm值的平均數(shù)；S為各待檢樣品OD650nm值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)豬群中PRV-gE抗體檢測(cè)情況

5個(gè)地區(qū)的580份血清樣品中，PRV-gE抗體陽(yáng)性樣品有164份，平均陽(yáng)性率為28.28%（164/580）。其中，克拉瑪依地區(qū)PRV-gE抗體陽(yáng)性率最高，為74.29%（26/35）；阿克蘇地區(qū)PRV-gE抗體陽(yáng)性率最低，為18.03%（53/294）。5個(gè)地區(qū)的平均S/N值為0.76。其中，克拉瑪依地區(qū)的平均S/N值最小，為0.34；阿克蘇地區(qū)的平均S/N值最大，為0.89?？死斠赖貐^(qū)與其余4個(gè)地區(qū)之間的PRV-gE抗體水平均存在顯著差異（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新疆不同地區(qū)PRV-gE蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同規(guī)模化豬場(chǎng)PRV-gE蛋白抗體檢測(cè)情況

9個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（A～I(xiàn)）PRV-gE平均陽(yáng)性率為28.28%（164/580）。其中，F(xiàn)場(chǎng)PRV-gE抗體陽(yáng)性率最高，為74.29%（26/35）；B場(chǎng)和H場(chǎng)PRV-gE抗體陽(yáng)性率最低，均為0。9個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)平均S/N值為0.76。其中，F(xiàn)場(chǎng)的平均S/N值最小，為0.34；B場(chǎng)的平均S/N值最大，為0.97。F場(chǎng)與其余8個(gè)豬場(chǎng)之間的PRV-gE抗體水平均存在顯著差異（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同規(guī)?；i場(chǎng)PRV-gE蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同地區(qū)豬群PRV免疫抗體檢測(cè)情況

PRV野毒感染和gE基因缺失苗免疫的豬只均可以產(chǎn)生抗gB蛋白的抗體，因此，要準(zhǔn)確評(píng)估PRV的疫苗免疫效果，應(yīng)當(dāng)剔除PRV野毒感染產(chǎn)生的抗gB蛋白抗體數(shù)據(jù)。在5個(gè)地區(qū)的580份血清樣品中，PRV免疫抗體陽(yáng)性樣品有359份，平均免疫抗體陽(yáng)性率為61.9%（359/580），低于國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)（70%）。5個(gè)地區(qū)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率均未達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。各個(gè)地區(qū)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率差異較大，其中，阿克蘇地區(qū)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率最高，為67.35%（198/294）；克拉瑪依地區(qū)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率最低，為8.57%（3/35），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同地區(qū)PRV免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同規(guī)?；i場(chǎng)PRV免疫抗體檢測(cè)情況

9個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（A～I(xiàn)）的PRV免疫抗體陽(yáng)性樣品有359份，平均免疫抗體陽(yáng)性率為61.90%（359/580）。在9個(gè)被調(diào)查豬場(chǎng)中，只有22.22%（2/9）豬場(chǎng)的免疫抗體陽(yáng)性率達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。各個(gè)豬場(chǎng)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率差異較大，其中，H場(chǎng)PRV免疫抗體陽(yáng)性率最高，為100.00%（13/13）；F場(chǎng)PRV免疫抗體陽(yáng)性率最低，為8.57%（3/35），結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同規(guī)模豬場(chǎng)PRV免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論與分析

3.1 新疆地區(qū)豬群PRV-gE抗體結(jié)果分析

PR是一種急性、烈性傳染病，也是威脅我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)主要疫病之一，能夠?qū)е氯焉锬肛i流產(chǎn)或產(chǎn)死胎[4]。我國(guó)的規(guī)模化豬場(chǎng)均使用PRV-gE基因缺失苗進(jìn)行免疫接種，在大多數(shù)情況下，PRV-gE抗體陽(yáng)性的豬只為PRV野毒感染。本試驗(yàn)對(duì)2021年新疆5個(gè)地區(qū)的豬群進(jìn)行了PRV-gE抗體檢測(cè)，其抗體平均陽(yáng)性率為28.28%。張魯安[5]和魏其等[6]分別對(duì)2005年、2018年北疆地區(qū)豬群PRV-gE抗體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其抗體陽(yáng)性率分別為10.1%和45.14%。齊向濤[7]、劉鴿等[8]和李靜等[2]分別對(duì)2014年、2016年和2019年新疆地區(qū)豬群PRV-gE抗體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其抗體陽(yáng)性率分別為27.8%、14.91%和44.67%。以上研究表明，新疆部分地區(qū)PRV野毒感染率存在波動(dòng)，但形勢(shì)仍較為嚴(yán)重。

3.2 新疆地區(qū)豬群PRV免疫抗體結(jié)果分析

囊膜糖蛋白gB是PRV復(fù)制必需的糖蛋白，不管是活疫苗免疫接種還是野毒感染都會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PRV-gB抗體。只有在排除野毒感染的情況下，gB抗體才代表的是疫苗免疫產(chǎn)生的抗體。因此，要準(zhǔn)確評(píng)估PRV的疫苗免疫效果，應(yīng)當(dāng)去除PRV野毒感染產(chǎn)生的抗gB蛋白抗體數(shù)據(jù)。對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2021年新疆部分地區(qū)豬場(chǎng)的PRV平均免疫抗體陽(yáng)性率為61.9%，低于國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。5個(gè)地區(qū)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率均未達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，僅有22.22%豬場(chǎng)的PRV免疫抗體陽(yáng)性率高于國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，各地區(qū)和各豬場(chǎng)間的PRV免疫抗體陽(yáng)性率差異較大。

4 結(jié)論

PR防控工作中，高效的基因缺失疫苗的推廣及PRV野毒感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法的聯(lián)合使用是PR防制的基礎(chǔ)[9]。本研究表明，2021年P(guān)RV在新疆部分地區(qū)仍然流行，形勢(shì)不容樂(lè)觀。新疆部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)平均免疫抗體陽(yáng)性率未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，只有22.22%（2/9）豬場(chǎng)的免疫抗體陽(yáng)性率達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。不同地區(qū)之間、各豬場(chǎng)之間PR防控水平層次不一。提示新疆部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)應(yīng)在加強(qiáng)PR免疫防控的基礎(chǔ)上，做好PR的綜合防控工作。