郭宗昱，郭一新，金偉其，何玉青，裘 溯

北京理工大學(xué)光電成像技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

引 言

轉(zhuǎn)基因作物是指利用重組DNA技術(shù)將克隆的外源基因?qū)胱魑锝M織并表達(dá)，從而獲得的具有特定目標(biāo)性狀的作物[1]。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA)統(tǒng)計(jì)報(bào)告，1996年—2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積攀升至1.917億公頃，發(fā)展中國家與發(fā)達(dá)國家分別占1.031億公頃和0.886億公頃，其中，轉(zhuǎn)基因大豆在全球的應(yīng)用率最高，占全球轉(zhuǎn)基因作物面積的50%。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)可增加作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、提高抗旱抗寒能力和其他特性，但轉(zhuǎn)基因作物也可能對(duì)生態(tài)環(huán)境造成潛在的威脅(如土壤生態(tài)系統(tǒng)和生物地球化學(xué)循環(huán)等)，甚至可能對(duì)生物種群造成嚴(yán)重影響[2]，因此，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)一直是人們關(guān)注的問題。我國是世界上主要的大豆消費(fèi)國和進(jìn)口國，截至2019年進(jìn)口的大豆量達(dá)8.34億噸，消費(fèi)量約為10億噸，其中絕大多數(shù)均為轉(zhuǎn)基因大豆[3]。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)了三款耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書批準(zhǔn)清單[4]。為了防止轉(zhuǎn)基因大豆在食品化中的濫用，解決食品標(biāo)識(shí)不清甚至魚龍混雜的問題，食品轉(zhuǎn)基因大豆成分檢測(cè)形勢(shì)非常迫切。

常見的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)主要有外源核酸檢測(cè)和外源蛋白檢測(cè)兩類。前者主要有定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-media isothermal ampli-fication, LAMP)等技術(shù)；后者主要有酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immune-sorbent assay, ELISA)、試紙條和Western blot等檢測(cè)技術(shù)[5-6]。這些檢測(cè)方法大多特異性強(qiáng)、檢測(cè)準(zhǔn)確度高，但對(duì)樣品提取的質(zhì)量要求高，預(yù)處理復(fù)雜，采樣檢測(cè)耗時(shí)較長且均為破壞性檢驗(yàn)，不僅對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，而且難以適應(yīng)在某些實(shí)際場合樣品量大且需要快速檢測(cè)的應(yīng)用需求。

拉曼光譜是一種無損的非接觸性光散射分析方法，譜峰位置、強(qiáng)弱及形狀可精確反映出有關(guān)物質(zhì)或混合物的結(jié)構(gòu)信息，因此常用來鑒別物質(zhì)和組分分析。拉曼光譜檢測(cè)無需預(yù)處理，不產(chǎn)生化學(xué)污染物，具有快速準(zhǔn)確、簡單高效、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于大豆油組分中包含大量碳-碳雙鍵(線性或環(huán)狀不飽和分子，具有大量的p鍵偶聯(lián))[7]，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)熒光背景[8]，對(duì)拉曼光譜的檢測(cè)產(chǎn)生較大干擾。相對(duì)于常見的可見光和近紅外拉曼光譜，紫外拉曼光譜的特點(diǎn)：①與熒光光譜大致分離[9]；②由于臭氧層對(duì)紫外線的隔離，紫外拉曼光譜受環(huán)境光干擾較小，適用現(xiàn)場遙測(cè)，應(yīng)用場景更廣泛；③拉曼散射強(qiáng)度與波長的四次方成反比[10]，在同等條件下紫外拉曼光譜對(duì)弱散射信號(hào)的探測(cè)更具優(yōu)勢(shì)，更適合實(shí)際現(xiàn)場的檢測(cè)。本文研究紫外拉曼光譜對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆油的鑒別方法，分析轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆油的分類可行性，為轉(zhuǎn)基因大豆油及其食品的現(xiàn)場檢測(cè)探索新的技術(shù)途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 紫外拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)

紫外拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)如圖1所示，主要由紫外激光器、拉曼光譜儀、熒光光譜儀和可見光相機(jī)組成。激光脈沖經(jīng)BS1(266 nm, Semrock, Bright Line)雙向色鏡反射，垂直穿過工作距離為15 mm的10倍紫外聚焦物鏡，到達(dá)樣品表面；樣品被激發(fā)出的光譜首先入射到BS1，濾去266 nm激光，透過大于266 nm的拉曼光譜、熒光譜及可見光等；BS2(310 nm, Semrock, Bright Line)處266～310 nm的光譜由采集頭收集，并通過光纖傳送至拉曼光譜儀；BS3(484 nm, Semrock, Bright Line)處310～484 nm光譜由光纖傳送至熒光光譜儀；最終的可見光(波長大于484 nm)由帶通反射鏡BPM反射至CCD相機(jī)成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)不可見紫外采樣點(diǎn)場景的搜索與瞄準(zhǔn)，同時(shí)熒光通道可結(jié)合門控技術(shù)計(jì)算熒光衰減時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的快速篩選。其中，266 nm長通濾光片LWP可抑制激光反射和瑞利散射；反綠光帶通濾光片BPM可避免熒光過強(qiáng)導(dǎo)致的過曝問題，同時(shí)反射綠光為CCD提供照明。光譜儀通過USB連接至電腦，由PyCharm(Python 3.8)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

系統(tǒng)采用長春光機(jī)所四倍頻Nd∶YAG脈沖激光器MPL-N-266，波長266 nm，平均功率為30 mW，脈寬5 ns，重頻3～5 kHz；拉曼通道采用海洋光學(xué)QE-pro光譜儀，光學(xué)分辨率0.14～7.7 nm(FWHM)，光譜檢測(cè)范圍265～300 nm；熒光通道采用海洋光學(xué)Maya 2000光譜儀，光學(xué)分辨率0.035 nm(FWHM)。

1.2 拉曼光譜的預(yù)處理

首先采用Savitzky-Golay濾波器[11]對(duì)原始光譜進(jìn)行降噪，提高光譜平滑性，再使用自適應(yīng)迭代加權(quán)懲罰最小二乘法(adaptive iteratively reweighted penalized least squares, airPLS)進(jìn)行基線校正。由于散射水平差異，同一樣品在不同時(shí)刻測(cè)得的光譜曲線有一定的偏移，對(duì)后續(xù)光譜分類的準(zhǔn)確性造成影響，采用多元散射校正(multiple-scattering corrections, MSC)[12]改善基線的偏移和平移。

圖1 本實(shí)驗(yàn)紫外拉曼光譜系統(tǒng)

1.3 光譜特征分類與識(shí)別方法

我們采用了一種不同監(jiān)督模式下拉曼光譜特征分類和識(shí)別方法，處理流程如圖2所示，其中各環(huán)節(jié)的作用大致為：

(1)基于支持向量機(jī)的光譜全局分類

支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)是一種二分類監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，基本模型定義為特征空間上間隔最大的線性分類器，通過核函數(shù)將向量投影至高維特征空間，建立最優(yōu)超平面以實(shí)現(xiàn)模式識(shí)別，利于解決小樣本、非線性、高維度數(shù)據(jù)[11]。

(2)基于主成分分析

對(duì)于大樣本數(shù)量情況，可優(yōu)先使用主成分分析(principal component analysis, PCA)進(jìn)行數(shù)據(jù)降維再使用其他分類識(shí)別方法。其作為目前光譜分析中常用的無監(jiān)督統(tǒng)計(jì)方法，可記錄原始變量的方差，降低數(shù)據(jù)維度并減小測(cè)量誤差[13]。

(3)基于PLS-DA的全局分析

偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)是一種常用的有監(jiān)督多元因子回歸方法，在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)行最小二乘回歸，可用于多變量數(shù)據(jù)的分類和判別[13]。本實(shí)驗(yàn)建立多類別分類模型，設(shè)定判定閾值在0.5，當(dāng)模型標(biāo)簽的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值差的絕對(duì)值大于0.5時(shí)，表明判別錯(cuò)誤；反之則判別正確。

SVM在The Unscrambler X軟件上實(shí)現(xiàn)，PCA、PLS-DA算法在PyCharm(Python 3.8)上實(shí)現(xiàn)。

圖2 拉曼光譜特征分類和識(shí)別方法流程圖

1.4 實(shí)驗(yàn)樣本及數(shù)據(jù)采集

實(shí)驗(yàn)樣本共有5種食用油(見表1)，其中兩種轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因大豆油(記為A和B類)和一種稻米油(記為C類)，外觀上無明顯差異。A、B類樣品作為轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因大豆油的鑒別依據(jù)，C類樣品作為對(duì)照研究大豆油和其他油類鑒別的可行性。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息

實(shí)驗(yàn)中樣品溫度維持在室溫，每種樣品取2 mL，裝入尺寸12.5 mm×12.5 mm×40 mm, 容量為3.5 mL的石英(可透日盲紫外)比色皿中，水平放置于樣品采集區(qū)檢測(cè)。使用OceanView軟件采集樣本光譜，光譜儀采用掃描次數(shù)10次的平均值作為一個(gè)樣本采集光譜。A類及B類樣本一次采集100組，共采集5次；C類樣本一次采集20組，共采集5次，共計(jì)2 100組數(shù)據(jù)。為了增加樣本的魯棒性，同類數(shù)據(jù)的采集均會(huì)間隔另一種不同類數(shù)據(jù)的采集，即不連續(xù)采集同一類樣本。

1.5 大豆油樣本的光譜特征曲線

不同種類大豆油及稻米油標(biāo)準(zhǔn)化的全譜圖如圖3所示，大豆油的拉曼譜圖曲線相似度較高，僅在強(qiáng)度和部分波數(shù)范圍內(nèi)有部分差異，無法直接從視覺上根據(jù)原始光譜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣本的區(qū)分。

圖3 不同種類大豆油及稻米油標(biāo)準(zhǔn)化的全譜圖

表2 樣品拉曼光譜特征峰的歸屬

2 結(jié)果與討論

2.1 全譜的支持向量機(jī)結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，基于SVM分析方法對(duì)不同的數(shù)據(jù)集劃分比例(4∶1，3∶1，1∶1等)進(jìn)行了多次測(cè)試，最終選擇判別準(zhǔn)確度最高的1: 1劃分方法。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)按類打亂，分別在各類中以1∶1隨機(jī)劃分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，并為訓(xùn)練集中五類樣本設(shè)置不同標(biāo)簽(如表1)：A類(-1/1)，B類(-2/2)，C類(0)；測(cè)試集不設(shè)置標(biāo)簽。將訓(xùn)練集的1 050組光譜數(shù)據(jù)及其標(biāo)簽值作為輸入，訓(xùn)練SVM模型；余下1 050組數(shù)據(jù)用于評(píng)估分類器的性能，輸入至訓(xùn)練完成的模型后得到分類的準(zhǔn)確率?；跇颖緮?shù)據(jù)分布特征，本文選擇建模效果較好的線性核函數(shù)，模型采用C-SVC。采用10折交叉驗(yàn)證，結(jié)合網(wǎng)格搜索算法(grid search, GS)選擇最佳懲罰因子C=1進(jìn)行模型訓(xùn)練。模型訓(xùn)練完成后，輸入測(cè)試集中的1 050組數(shù)據(jù)，獲得預(yù)測(cè)標(biāo)簽，與實(shí)際標(biāo)簽對(duì)比后最終得到分類的平均準(zhǔn)確率。分類結(jié)果如圖4所示，藍(lán)色為實(shí)際標(biāo)簽，紅色為預(yù)測(cè)標(biāo)簽，僅有兩個(gè)樣本標(biāo)簽預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，分類準(zhǔn)確率達(dá)到99.81%。表明紫外拉曼光譜結(jié)合支持向量機(jī)分析(SVM)，不僅對(duì)轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因大豆油的鑒別具有可行性，而且可區(qū)分大豆油和稻米油。

圖4 SVM算法對(duì)測(cè)試集樣品分類(1 050個(gè)樣品)

2.2 主成分分析算法

每種大豆油的光譜數(shù)據(jù)均有12個(gè)明顯的拉曼特征峰，采用主成分分析法(模型為NIPALS，最大迭代次數(shù)為100)對(duì)2 100組數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，提取出8個(gè)主成分，從第9個(gè)主成分開始不收斂。前8個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率見表3，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)74.84%，可以代表大部分原始數(shù)據(jù)的特征。驗(yàn)證集和校準(zhǔn)集的累計(jì)貢獻(xiàn)率見圖5，可見校準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)整體貢獻(xiàn)率有略微提升。

表3 全局?jǐn)?shù)據(jù)主成分分析得分情況

圖5 驗(yàn)證集和校準(zhǔn)集中前8個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率

為了直觀表現(xiàn)不同樣本的相關(guān)程度，使用聚類圖展示前三個(gè)主成分的分布特征，見圖6。前三個(gè)主成分間交疊程度較大，區(qū)分度不夠明顯，說明使用三個(gè)主成分無法較好實(shí)現(xiàn)分類，需要進(jìn)一步分析。

圖6 四種大豆油光譜數(shù)據(jù)前3個(gè)主成分散點(diǎn)圖

2.3 全譜的PLS-DA

相較于無監(jiān)督式的PCA分析方法，偏最小二乘回歸(PLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，結(jié)合了主成分分析和相關(guān)分析思想，利用PLS降維獲得的特征變量不僅可以代表原始變量信息，而且對(duì)因變量有較強(qiáng)的解釋能力。本文將建立光譜特征與樣本類別標(biāo)簽之間的關(guān)系模型，以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品種類的預(yù)測(cè)。從實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，我們基于PLS-DA分析方法對(duì)不同的數(shù)據(jù)集劃分比例(4∶1，3∶1，1∶1等)進(jìn)行了多次測(cè)試，最終選擇判別準(zhǔn)確率最高的4∶1劃分方法。將數(shù)據(jù)集以4∶1劃分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，將訓(xùn)練集中的1 680組樣本數(shù)據(jù)作為輸入，采用10折交叉驗(yàn)證，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)特征(大量樣本及較少變量的數(shù)據(jù))，使用更加合適的Kernel PLS模型進(jìn)行訓(xùn)練。建模完成后，對(duì)得到的主成分進(jìn)行繪制，并對(duì)不同類樣本進(jìn)行標(biāo)識(shí)。圖7給出PLS-DA模型對(duì)樣品訓(xùn)練集的預(yù)測(cè)值，可以看出：四種大豆油(☆，A類非轉(zhuǎn)基因；○，A類轉(zhuǎn)基因；×，B類非轉(zhuǎn)基因；?，B類轉(zhuǎn)基因)與稻米油(?，C類)有顯著差異，無交疊部分，區(qū)分度達(dá)100%；四種大豆油集中分布在同一區(qū)域(以原點(diǎn)為中心的四個(gè)象限內(nèi))，分布上存在差異，但有部分交疊，這是因?yàn)椴煌惔蠖褂偷睦庾V具有相似線型，同時(shí)特征峰位置基本一致，僅存在強(qiáng)度方面的差異。

圖7 PLS-DA模型中五類樣品的分布情況

模型建立后，輸入測(cè)試集的420組樣品，得到預(yù)測(cè)的標(biāo)簽值，將其與實(shí)際標(biāo)簽值對(duì)比，判別閾值設(shè)置為0.5，PLS-DA模型對(duì)樣品測(cè)試集的預(yù)測(cè)情況如圖8。結(jié)合圖7及圖8的數(shù)據(jù)分布得到，稻米油(C類)與其他樣品的差異較大，模型建立效果較好，僅有一個(gè)樣本標(biāo)簽預(yù)測(cè)錯(cuò)誤；由于不同類大豆油拉曼譜線相似，數(shù)據(jù)分布存在重疊，會(huì)對(duì)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率產(chǎn)生一定的誤差，但不影響大部分?jǐn)?shù)據(jù)的預(yù)測(cè)。根據(jù)計(jì)算最終得到模型的判別準(zhǔn)確率達(dá)70.95%，這表明紫外拉曼光譜結(jié)合PLS-DA分析方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆油的鑒別具有可行性。

圖8 PLS-DA模型對(duì)樣品測(cè)試集的預(yù)測(cè)情況

3 結(jié) 論

采用紫外拉曼光譜技術(shù)，結(jié)合支持向量機(jī)，主成分分析以及偏最小二乘回歸分析法，對(duì)稻米油、轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因大豆油進(jìn)行鑒別研究，并取得較好的鑒別效果。論文實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練集和測(cè)試集分別為1 680組和420組，使用支持向量機(jī)對(duì)油品進(jìn)行建模時(shí)的識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)99.81%；采用無監(jiān)督式的主成分分析法對(duì)樣品建模時(shí)，可提取出8個(gè)特征峰，主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為74.84%，可以代表大部分原始數(shù)據(jù)特征，但無法提升到80%以上，存在局限性；使用有監(jiān)督式偏最小二乘回歸分析法PLS-DA時(shí)，模型中樣本可分，但存在部分重疊，經(jīng)過對(duì)驗(yàn)證集樣品標(biāo)簽的預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確率為70.95%，說明PLS-DA可成功預(yù)測(cè)大部分轉(zhuǎn)基因大豆油類型。綜上所述，針對(duì)紫外拉曼光譜鑒別轉(zhuǎn)基因大豆油，采用有監(jiān)督分類法的效果優(yōu)于無監(jiān)督分類法。

由于紫外拉曼光譜檢測(cè)儀可以在自然環(huán)境下進(jìn)行一定距離的遙測(cè)，不僅可對(duì)毒品、爆炸物等危險(xiǎn)品進(jìn)行有效檢測(cè)，也可望為市場上各類轉(zhuǎn)基因、添加劑或過期食品的檢測(cè)提供一種高效率的有效方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。