歐麗娟，李 京，張超群，羅建新，韋 吉，王海波，張春燕

1.湖南工學院材料科學與工程學院，湖南 衡陽 421002 2.信陽師范學院化學化工學院，河南 信陽 464000

引 言

過氧化氫(H2O2)是生物體系中非常重要的含活性氧的小分子化合物。它能調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化等多種生理過程，對生物體的平衡至關(guān)重要。此外，H2O2是織物纖維的高效漂白劑和醫(yī)療、環(huán)境消毒劑。但是高濃度的H2O2會導致細胞老化，進而對人體組織、器官造成損傷，引發(fā)多種疾病，如人體衰老、阿爾茲海默癥等[1]。因此，H2O2的日常檢測非常必要。葡萄糖是一種可被葡萄糖氧化酶(GOx)氧化產(chǎn)生H2O2的糖。它不僅是活細胞的主要能量來源，也是動植物循環(huán)過程中的代謝中間體[2]。葡萄糖水平異常是某些疾病的指標，如糖尿病或低血糖。因此，開發(fā)高靈敏、簡單的葡萄糖分析方法對預防或延緩糖尿病及其并發(fā)癥如膽道炎、中風等具有重要意義。

金納米簇(AuNCs)作為一種典型的貴金屬納米簇，具有合成簡單、穩(wěn)定性好、熒光性質(zhì)優(yōu)異和生物相容性良好等突出的性能，在生物傳感應用中備受青睞[3-5]。半胱氨酸(Cys)是一種硫醇功能化合物，其強烈的Au—S鍵合，常被選擇為AuNCs的猝滅劑[6-7]。此外，H2O2可氧化半胱氨酸成二硫化合物，且該氧化反應具有較高的特異性和敏感性，可用于構(gòu)建過氧化氫相關(guān)的生物傳感方法[8-9]。

本研究建立了一種基于H2O2調(diào)控AuNCs熒光的簡便、靈敏的“關(guān)-開”策略用于H2O2和葡萄糖檢測(圖1)。制備的AuNCs具有明顯的熒光發(fā)射。Cys存在下，Au—S鍵的形成有效的猝滅AuNCs熒光。而H2O2的加入將Cys氧化成二硫鍵的胱氨酸。二硫鍵的形成抑制了Au—S鍵合反應引發(fā)的猝滅效應，AuNCs發(fā)射出強烈的熒光信號。此外，GOx可以在氧氣存在下特異性催化葡萄糖生成H2O2[10]。因此，通過GOx催化葡萄糖生成H2O2可以實現(xiàn)對葡萄糖的檢測。更重要的是，該方法具有高度的通用性，無需調(diào)整方法的復雜性，即可檢測其他酶催化產(chǎn)生過氧化氫體系的分析物檢測。

圖1 熒光“關(guān)-開”策略檢測H2O2和葡萄糖的原理

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

A15寡聚核苷酸鏈購于上海生工生物工程公司。氯金酸(HAuCl4)、半胱氨酸(Cys)、葡萄糖(Glu)、葡萄糖氧化酶(GOx)、胎牛血清(FBS)均購于上海阿拉丁生化科技有限公司。過氧化氫(H2O2)、檸檬酸鈉、木糖(Xyl)、蔗糖(Suc)、乳糖(Mal)由上海麥克林生化科技有限公司提供。試劑均為分析純，水為超純水(電阻大于18.25 MΩ)。

熒光分光光度計(美國安捷倫公司，Cary Eclipse)。臺式高速冷凍離心機(長沙東旺實驗儀器有限公司，TG20KR)。酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司，PHS-3C)。

1.2 熒光金納米簇的合成

參照文獻[11]，將600 nmol·L-1的A15寡聚核苷酸鏈與2 mmol·L-1檸檬酸鈉(pH 6.0)、50 μmol·L-1HAuCl4溶液混合，在85 ℃反應30 min，得到金納米簇熒光探針，置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 過氧化氫和葡萄糖的檢測

在50 μL 10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，加入不同濃度的過氧化氫或葡萄糖/GOx(6 μg·mL-1)和4 μmol·L-1半胱氨酸，混合均勻后37 ℃反應15 min。再加入50 μL金納米簇，室溫下反應10 min。290 nm激發(fā)波長下，400～560 nm波長范圍內(nèi)掃描熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的可行性

如圖2所示，金納米簇的最大熒光發(fā)射波長為471 nm(曲線a)，加入4 μmol·L-1的半胱氨酸后，最大熒光發(fā)射波長的熒光強度迅速降低，86%的熒光強度被有效的猝滅(曲線b)。分析認為半胱氨酸的巰基(—S)與金納米簇結(jié)合形成穩(wěn)定的Au—S鍵，猝滅了金納米簇的熒光。在體系中引入H2O2后，金納米簇在471 nm處出現(xiàn)了較強的的熒光發(fā)射(曲線c)。眾所周知，H2O2是一種強氧化劑，可以猝滅金納米簇的熒光。實驗展開了單獨的H2O2對金納米簇熒光影響的對照實驗。從曲線d可知，100 μmol·L-1H2O2的加入會使金納米簇熒光強度降低。然而，在體系中加入半胱氨酸和H2O2(曲線c)的熒光強度明顯高于單獨的H2O2(曲線d)，表明H2O2成功地將半胱氨酸中的單巰基—S氧化為雙巰基S—S的胱氨酸。沒有單巰基可以與金納米簇發(fā)生化學鍵合反應，金納米簇呈現(xiàn)出明顯的熒光信號。以上結(jié)果表明，利用H2O2氧化半胱氨酸調(diào)控金納米簇熒光強度的變化檢測H2O2和葡萄糖的方法是可行的。

圖2 不同體系的AuNCs的熒光發(fā)射光譜圖AuNCs(a); AuNCs+Cys(b);(Cys+H2O2)+AuNCs(c); H2O2+AuNCs(d)

2.2 實驗條件優(yōu)化

考察了不同實驗條件：半胱氨酸濃度、H2O2與半胱氨酸反應時間，AuNCs與胱氨酸反應時間對傳感器性能的影響。

由圖3(a)可知，隨著半胱氨酸濃度的增加，信背比F/F0(F和F0分別表示H2O2存在和不存在時金納米簇的熒光強度)逐漸增強。當Cys的濃度高于4.0 μmol·L-1時，信背比反而降低。分析認為隨著半胱氨酸濃度的增加，半胱氨酸對AuNCs的猝滅效率提高。然而過量的Cys不能被H2O2氧化，其對AuNCs的熒光強度效應仍然存在，導致最終的信背比變小。因此選擇4.0 μmol·L-1為Cys的最佳濃度。

圖3(b)是H2O2與半胱氨酸反應時間對檢測體系的影響。理論上，時間越長，H2O2氧化半胱氨酸為胱氨酸的反應進行得越完全。但是，實驗發(fā)現(xiàn)長的反應時間增加了背景的熒光強度，導致信背比降低。故選取15 min作為H2O2與半胱氨酸的反應時間。

實驗還考察了金納米簇與氧化產(chǎn)物(胱氨酸)反應所需的時間。實驗發(fā)現(xiàn)，反應時間的變化對信號熒光強度F無影響，分析認為胱氨酸不能與AuNCs結(jié)合。另外，半胱氨酸與AuNCs之間的猝滅反應非常迅速，1 min內(nèi)熒光強度F0急劇下降，5 min后熒光強度F0下降緩慢。因此，隨著反應時間的延長，信背比F/F0基本保持不變[圖3(c)]。為了保證完全的猝滅反應，選取10 min作為AuNCs與胱氨酸的反應時間。

2.4 傳感器的分析性能

在優(yōu)化的實驗條件下，探究了本方法對過氧化氫和葡萄糖檢測的分析性能。隨著過氧化氫[圖4(a)]和葡萄糖[圖5(a)]濃度的增加，金納米簇在471 nm處的熒光發(fā)射峰逐漸增強。金屬納米簇的熒光強度增值(F/F0)與過氧化氫濃度在10～100 μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[圖4(b)]，用空白的三倍標準偏差原則計算檢出限為2.8 μmol·L-1。葡萄糖濃度在10～200 μmol·L-1范圍內(nèi)與金納米簇熒光增值呈線性關(guān)系[圖5(b)]，檢出限為3.1 μmol·L-1。該方法檢測過氧化氫和葡萄糖的靈敏度可與其他基于納米材料的光學生物傳感技術(shù)相媲美，同時本方法更快速，操作簡單，成本低廉[12-15]。

圖3 (a)半胱氨酸濃度的優(yōu)化；(b)H2O2與半胱氨酸反應時間的優(yōu)化；(c)AuNCs與胱氨酸反應時間的優(yōu)化

圖4 (a)不同H2O2濃度對應的熒光發(fā)射光譜圖(從下至上：0, 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 500 μmol·L-1);(b)熒光強度與H2O2濃度的線性關(guān)系; 插圖：校正曲線

圖5 (a)不同葡萄糖濃度對應的熒光發(fā)射光譜圖(從下至上：0, 10, 40, 60, 80, 100, 140, 200, 400 μmol·L-1);(b)熒光強度與葡萄糖濃度的線性關(guān)系; 插圖：校正曲線

選取木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖4種糖類化合物和K+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Ca2+，Mg2+5種金屬離子作為干擾物質(zhì)，考察了該方法的選擇性。如圖6所示，干擾物質(zhì)的加入，不影響半胱氨酸對金納米簇的熒光猝滅；而加入葡萄糖后，金納米簇才有顯著的熒光強度，說明本方法對葡萄糖具有高度的選擇性。

圖6 選擇性考察

用該方法檢測了胎牛血清中的葡萄糖。將胎牛血清樣品預先用蒸餾水稀釋10倍，并加入不同濃度的葡萄糖標準溶液實驗結(jié)果見表1。測得的加標回收率在94.5%～112.7%之間，相對標準偏差(RSD)小于3.5%，表明該方法具有檢測實際樣品中葡萄糖的潛能。

表1 FBS中葡萄糖檢測的加標回收率

3 結(jié) 論

采用熒光性能優(yōu)異且穩(wěn)定的金納米簇為報告探針，半胱氨酸作為猝滅劑，建立了一種氧化反應調(diào)控金納米簇熒光的“關(guān)-開”型傳感方法用于過氧化氫和葡萄糖的檢測。在金納米簇中加入半胱氨酸，半胱氨酸與金納米簇的S-Au鍵合作用導致熒光猝滅。在過氧化氫/葡萄糖(GOx)存在下，半胱氨酸被氧化為胱氨酸。雙巰基的胱氨酸不能猝滅金納米簇的熒光，體系中呈現(xiàn)出強烈的熒光發(fā)射。通過金納米簇熒光強度的變化，實現(xiàn)了對過氧化氫和葡萄糖的簡單、快速、高靈敏性和高選擇性檢測，檢出限分別為2.8和3.1 μmol·L-1。同時，該策略成功地應用于FBS中葡萄糖的檢測，在實際環(huán)境樣品分析中具有潛在的應用前景。本方法可擴展到其他可產(chǎn)生過氧化氫體系的目標物檢測等，為生物分析和生物傳感提供新的研究思路。