王 芳，朱 南，陳靖奕，昝佳男，肖子康，劉 暢，劉云飛*

1.南京曉莊學院電子工程學院，江蘇 南京 211171 2.南京市產品質量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210019 3.南京林業(yè)大學信息科學技術學院，江蘇 南京 210037

引 言

質保期內，被遺忘在車內長達數月的藥品還能吃嗎？ 藥物存儲不當，會導致質保期內藥物結構和晶型的改變嗎？ 從而導致藥物藥效的改變，甚至危害生命健康？ 帶著這個疑問，首次研究了質保期內，六種常見抗生素類藥物，三種治療COVID-19抗病毒藥物以及一種祛痰類藥物的紅外振動光譜。這些是現(xiàn)階段，治療COVID-19的常見聯(lián)用藥物。人工模擬車載等高溫(65 ℃)存儲環(huán)境，樣品被密封保存在高溫環(huán)境下每日12～14 h，經兩個多月連續(xù)不間斷實驗，試圖發(fā)現(xiàn)溫度對藥品晶型和結構的影響。

目前常用于藥品快速檢測的方法有高效液相色譜法(HPLC)，紅外光譜法(這里特指中紅外)，拉曼光譜法等[1-2]。HPLC法成本較高，樣品前處理較為復雜；中紅外光譜和拉曼光譜主要反映的是分子基團的振動，能將分子結構的變化反映到光譜變化上，但無法分辨出同分異構體或者不同晶型的同種物質。遠紅外光譜，又被稱為太赫茲光譜，其反映的是分子間的弱相互作用(如氫鍵、范德華力等)，對于晶體構型的變化十分敏感，許多低頻的晶格振動(如分子骨架的振動)均落在該波段[3-4]。本工作將遠紅外和中紅外光譜技術相結合，既可監(jiān)測分子晶型的轉變，又可及時發(fā)現(xiàn)分子結構的變化。

結合密度泛函理論，使用Crystal14和Gaussian16軟件，以氧氟沙星和諾氟沙星為例，對其單分子、多聚體和晶體結構進行晶格能、晶格參數和振動光譜的計算；同時，借助勢能分布(PED)方法，結合GaussView6.0可視化軟件，準確得知特征峰由哪些基團或原子群的振動主導及其貢獻率，完成對實驗光譜中所有特征峰的精準指認，闡明特征峰的來源。

1 實驗部分

1.1 儀器

中紅外和遠紅外光譜均在德國Bruker公司的Vertex80V傅里葉紅外光譜儀上測試完成，波數范圍為10～15 500 cm-1。中紅外波段，有效波數范圍為：400～4 000 cm-1；遠紅外波段，選擇6 μm分束器，實測有效波數范圍為：33～330 cm-1(1～10 THz)。選擇上海一恒DHG-9245A溫度可調，電熱鼓風干燥箱存儲實驗藥品，溫度設置為65 ℃。樣品被密封保存在高溫環(huán)境下每日12～14 h，其他時間關閉干燥箱電源，模擬晝夜交替狀態(tài)。每7日取樣一次，測試樣品的中紅外和遠紅外光譜。

1.2 樣品制備與方法

所有藥品均購于不同的醫(yī)藥公司，如：諾氟沙星膠囊(Norfloxacin，C16H18FN3O3)購于石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，國藥準字H13022807，白色顆粒狀，每粒0.1 g；氧氟沙星(Ofloxacin，C18H20FN3O4)購于上海復旦復華藥業(yè)有限公司，白色片狀，每片0.1 g。2021年5月12日，將購買自藥店的十種藥品，保留原包裝，放入密封盒，將密封盒置于干燥箱中。每7日取出一粒樣品用于測試分析，直到2021年7月15日結束實驗，共歷時64 d。為了得到藥品精準的紅外光譜，同時購買了部分藥品的純樣，用于比對分析。諾氟沙星、氧氟沙星、利巴韋林、磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾純樣購于Sigma-Aldrich公司，純度99%以上。膠囊類藥品，測試時去除膠囊外殼取樣；片狀藥品，敲碎取內部樣。遠紅外光譜測試時，將樣品與聚乙烯以1∶10的質量比混合，均勻研磨后壓成直徑為13 mm，厚度約0.5～1 mm薄片測試。為了消除聚乙烯吸收的影響，制備純聚乙烯樣品作為測試背景。此外，實驗過程中同時對儀器的樣品腔和光學腔抽真空來減少環(huán)境中水汽對光譜的影響。中紅外測試相對簡單，只需將儀器的光學腔置于真空，樣品腔處在標準大氣壓下。同時將極少量的樣品與溴化鉀混合均勻，充分研磨后快速壓成13 mm的透明薄片測試。所有測試均在室溫下完成，每種樣品平行測試三次，取平均值。

2 理論分析方法

用于理論計算的諾氟沙星和氧氟沙星多聚體和晶體結構來自劍橋晶體庫(cambridge structural database, CSD)。其中，諾氟沙星為三斜晶系[5]，單晶胞中含兩個諾氟沙星分子；氧氟沙星為單斜晶系[6]，單晶胞中含八個氧氟沙星分子。圖1為諾氟沙星單分子(a)和晶體結構(b)(虛線為分子間弱相互作用，主要為范德華力)。氧氟沙星的單分子和晶體結構見圖S1，晶體結構中分子間弱相互作用同樣以范德華力為主，還存在部分氫鍵。

圖1 諾氟沙星單分子(優(yōu)化后, a)和晶體(b)結構

圖S1 氧氟沙星單分子(優(yōu)化后, a)和晶體(b)結構

對于晶體結構，選擇考慮了周期性邊界條件的密度泛函理論，結合B3LYP/6-311++G(d, p)方法和基組，利用Crystal14軟件，在高性能CPU服務器上計算得到優(yōu)化后結構的振動光譜，結果無虛頻。計算過程中添加了倫敦色散校正系數，TOLINTEG=(10 10 10 10 20)。對于單分子和多聚體(未考慮周期性邊界條件)結構，同樣選擇基于密度泛函理論的B3LYP/6-311++G(d, p)方法和基組，利用Guassian16軟件，計算獲得結構的理論振動光譜。

3 結果與討論

3.1 遠紅外光譜表征研究

測試了氧氟沙星片、諾氟沙星膠囊等六種抗生素藥物，利巴韋林等三種抗病毒藥物，及鹽酸氨溴索片不同取樣日期的遠紅外(FIR)光譜。圖2為氧氟沙星片、氧氟沙星膠囊、諾氟沙星膠囊和鹽酸氨溴索片不同取樣日期遠紅外光譜對比圖，圖中已標明取樣(測試)日期，其他藥物的遠紅外光譜見圖S2。觀察圖2和圖S2后發(fā)現(xiàn)，除鹽酸氨溴索片置于高溫環(huán)境下十多天后，3 THz附近的特征峰發(fā)生了藍移，且6月17日取樣的測試光譜與其他日期測試光譜存在明顯差異外，高溫環(huán)境沒有造成藥物晶型或結構的改變。只要密封保存，膠囊和片劑等不同包裝方式，也不會影響其藥物的穩(wěn)定性。結合圖S4(d)中6月17日鹽酸氨溴索片的中紅外數據，發(fā)現(xiàn)，光譜中主要特征峰位置和強度沒有改變，說明藥物結構沒有發(fā)生明顯變化，推測藥物晶型發(fā)生了改變。進一步查閱大量文獻后發(fā)現(xiàn)，鹽酸氨溴索晶型受溫度影響極大。有報道將鹽酸氨溴索溶解，在控制溫度的情況下通入HCl，然后過濾、干燥和結晶，就可以獲取新晶型，新晶型安全性和有效性還需進一步驗證。從另一方面也可以看出，利用遠紅外光譜技術，可以實時監(jiān)控藥物晶型的轉變。

圖2 氧氟沙星片(a)、氧氟沙星膠囊(b)、諾氟沙星膠囊(c)和鹽酸氨溴索片(d)，不同取樣日期的遠紅外光譜比對圖，圖中已標明取樣日期；氧氟沙星片和膠囊在整個實驗階段光譜均未發(fā)生肉眼可見的改變，故只放了三組日期的數據

對比圖2(a)和圖2(b)中氧氟沙星片和氧氟沙星膠囊的遠紅外光譜，可以發(fā)現(xiàn)，主要特征峰的位置和強度幾乎一致，但也存在細微的差異，比如氧氟沙星片在3 THz處可觀察到一個較弱的特征峰，而在氧氟沙星膠囊的光譜中未發(fā)現(xiàn)該峰。分析認為藥店購買的成品藥雖主要成分一致，但添加了少量輔藥，如糖類或淀粉類。為了排除輔藥對光譜的影響，購買了諾氟沙星、氧氟沙星、利巴韋林、鹽酸阿比多爾和磷酸氯喹純樣，并測試其紅外光譜，結合理論分析結果，對光譜作出精準解析。圖3為氧氟沙星和諾氟沙星實驗(純樣)和理論(基于單體、多聚體和晶體)遠紅外光譜比對圖。氧氟沙星膠囊和諾氟沙星膠囊的遠紅外光譜幾乎與純樣無異，氧氟沙星片3 THz處的特征峰來源于少量輔藥，用于粘合或者改善吞咽口感。表1為諾氟沙星和氧氟沙星遠紅外光譜中所有特征峰位置及其對應的振動模式。利巴韋林、鹽酸阿比多爾和磷酸氯喹純樣的遠紅外光譜圖見圖S3。比對后發(fā)現(xiàn)，利巴韋林、鹽酸阿比多爾和磷酸氯喹純樣和藥店購買的成品藥的遠紅外光譜也幾乎完全一致，再次說明成品藥中輔藥含量較低，對遠紅外光譜的影響可忽略。表S1列出了文中其他幾種抗生素和抗病毒類藥物遠紅外光譜中主要特征峰位置，供其他研究者參考。

圖S2 利巴韋林片(a)、鹽酸阿比多爾片(b)、磷酸氯喹片(c)、阿奇霉素片(d)、羅紅霉素片(e)和鹽酸左氧氟沙星(f)，不同取樣日期的遠紅外光譜比對圖

觀察圖3，可以發(fā)現(xiàn)，單體的理論光譜與實驗光譜相差較大，多聚體的理論光譜雖更加接近實驗光譜，但只有考慮了周期性邊界條件的晶體結構才能最好地描述實驗結果，這在文獻[7-9]做過詳細介紹。在這里，我們可以進一步的通過分析結構的吉布斯自由能，得到分子間的相互作用能

ΔEint=ET+∑Ei+EBSSE

(1)

式(1)中，ΔEint是分子間相互作用能,ET是結構的總吉布斯自由能, ∑Ei是結構中每個分子的吉布斯自由能之和。EBSSE是基組疊加誤差能(基組精度越高，疊加誤差能越小)，選擇B3LYP/6-311++G(d, p)基組，該項幾乎可忽略。經過分析發(fā)現(xiàn)，從氧氟沙星單分子到多聚體，再到晶體，分子間作用能約為6.034 Hartree(3 786.335 kcal·mol-1, 1 Hartree=627.5 kcal·mol-1)，主要來自晶胞間的堆積力。同樣，從諾氟沙星二聚體到晶體，分子間作用能約為1 681.54 kcal·mol-1，均來自晶胞間的堆積力等?？梢钥闯?，反映分子間弱相互作用的遠紅外光譜中，晶格間的弱相互作用(堆積力等)貢獻最大，這也是理論計算要無限接近實驗結果，必須考慮周期性邊界條件的根本原因。

圖3 諾氟沙星(a)和氧氟沙星(b)實驗(純樣)和理論(基于單體、多聚體和晶體)遠紅外光譜比對圖

表1 諾氟沙星和氧氟沙星遠紅外光譜中所有特征峰位置及其對應的振動模式

表S1 其他幾種抗生素和抗病毒類藥物遠紅外光譜中主要特征峰位置(THz)

圖S3 利巴韋林、磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾純樣的遠紅外實驗光譜圖

3.2 中紅外光譜表征研究

圖4為諾氟沙星膠囊和氧氟沙星片不同取樣日期的中紅外光譜，其他八種藥物的中紅外光譜分別見圖S4?？梢钥闯?，所有十種藥物不同取樣日期的中紅外光譜均沒有明顯差異，說明兩個多月的高溫環(huán)境沒有改變藥物的分子結構，所有基團和原子的振動峰依然清晰可見。氧氟沙星片和氧氟沙星膠囊主要特征峰位置和強度無明顯差異。通過與《藥品紅外光譜集》中已有藥品光譜(氧氟沙星光譜號1003，諾氟沙星光譜號1202，利巴韋林光譜號22，阿奇霉素光譜號772，羅紅霉素光譜號786，鹽酸左氧氟沙星光譜號1012，鹽酸氨溴索光譜號839/1102)比對后，再次印證了這一結論，購買成品藥中紅外光譜與原料藥測試結果幾乎一致。因鹽酸阿比多爾和磷酸氯喹的中紅外光譜未有報道，故購買了純樣進行測試，中紅外光譜如圖S5所示，結論與前述一致。

圖5分別為諾氟沙星中紅外實驗光譜(基于純樣)和理論光譜(基于單體、二聚體和晶體結構)。圖S6分別為氧氟沙星中紅外實驗光譜(基于純樣)和理論光譜(基于單體和晶體結構)。因理論計算基于諧振子模型，而實驗環(huán)境復雜，一般會通過給理論光譜乘以一個頻率校正因子，來消除理論偏差，校正因子的大小取決于選擇的理論計算方法和基組。本工作選擇基于密度泛函理論(DFT)的B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，故乘上了0.977的頻率校正因子[10]。從圖中可以看出，基于晶體結構的理論計算結果最接近實驗值，說明中紅外波段不僅存在分子內相互作用，還存在一些分子間相互作用。1 000 cm-1以下，以所有分子參與的面內外彎曲振動為主；1 000 cm-1以上，過渡為C—H鍵的面外彎曲和搖擺振動，以及C—O和O—H鍵的面內伸縮振動。諾氟沙星在400～750 cm-1，分子的集體振動依舊是主要振動模式，以苯環(huán)的面內搖擺和喹啉環(huán)的不對稱伸縮為主。在827～1 349 cm-1，主要表現(xiàn)為哌嗪基的面外搖擺振動(750，827，935，1 029，1 277和1 349 cm-1)。1 582 cm-1對應喹啉環(huán)的不對稱伸縮振動，1 600 cm-1以上主要表現(xiàn)為其他骨架的伸縮振動。值得注意的是，在1 440 cm-1處的特征峰僅在基于晶體構型的計算結果中出現(xiàn)，位于1 436 cm-1附近，該峰的成因可能由晶胞中分子間的相互作用力，因此在基于單分子構型的計算結果中并沒有出現(xiàn)。氧氟沙星在750 cm-1以下同樣主要表現(xiàn)為分子的集體振動，以哌嗪基和喹啉環(huán)的不對稱伸縮、面外搖擺振動為主。706和1 201 cm-1處特征峰分別來自羧基的面外彎曲和不對稱拉伸振動。另外在982，1 090，1 350及1 468 cm-1表現(xiàn)為甲基振轉動。1 524 cm-1處特征峰，也僅在晶體結構的計算結果中出現(xiàn)，位于1 521 cm-1附近，由分子間O—H…O氫鍵振動所引起的，因此在基于單分子構型的理論計算中沒有出現(xiàn)。

圖4 諾氟沙星膠囊(a)和氧氟沙星片(b)，不同取樣日期中紅外光譜比對圖

圖S4 利巴韋林片(a)、鹽酸阿比多爾片(b)、磷酸氯喹片(c)、鹽酸氨溴索片(d)、阿奇霉素片(e)氧氟沙星膠囊(f)、羅紅霉素片(g)和鹽酸左氧氟沙星(h)，不同取樣日期的中紅外光譜比對圖

圖5 諾氟沙星中紅外理論光譜(基于單體、二聚體(a)和晶體(b))和實驗光譜(基于純樣，c)

圖S5 鹽酸阿比多爾和磷酸氯喹純樣的中紅外光譜圖

圖S6 氧氟沙星中紅外理論光譜(基于單體(a)和晶體(b))和實驗光譜(基于純樣，c)

4 結 論

研究了質保期內六種常見抗生素類藥物、三種抗病毒類藥物及一種祛痰藥物的遠紅外和中紅外光譜，并研究了存儲環(huán)境中溫度對藥物結構和晶型的影響。發(fā)現(xiàn)，除鹽酸氨溴索片外，兩個多月的高溫環(huán)境(65 ℃)對藥物結構和晶型影響不大，可正常使用。鹽酸氨溴索片因其自身晶型易受溫度影響，故除需按照廠家推薦遮光、密封保存外，還需貯藏于常溫環(huán)境。將遠紅外和中紅外光譜技術相結合，不僅可以及時發(fā)現(xiàn)藥物晶型的轉變，還可發(fā)現(xiàn)鹽酸氨溴索片藥物結構并沒有發(fā)生改變，所有特征峰位置和強度均清晰可見。研究還發(fā)現(xiàn)，購買的成品藥遠紅外和中紅外光譜與原料藥測試結果幾乎一致，說明成品藥內的少量輔藥對紅外光譜影響不大。將DFT和PED方法相結合，可實現(xiàn)對光譜的精準指認，遠紅外光譜中表達特征信息的分子間弱相互作用，主要來自晶格間的堆積力引起的面外彎曲振動，貢獻率超過90%。