邢東旭， 李慶榮， 肖 陽， 趙超藝， 楊 瓊*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000)

僵蠶是一種優(yōu)良的動(dòng)物類中藥材，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)的功效[1]，臨床應(yīng)用廣泛[2-3]。9%～9.6%成人用藥含僵蠶，兒童用藥中含僵蠶的比例則高達(dá)40%～45.3%[4]。僵蠶水提物或醇提物具有抗驚厥、抗癲癇、抗凝血等多種藥理活性[5-7]。

僵蠶年需求量在3 000噸左右，主要來自蠶區(qū)收集的病死僵蠶[8]。隨著蠶病防治技術(shù)的進(jìn)步，僵病的發(fā)生得到有效控制，造成僵蠶原料日趨緊缺[9]。草酸銨是僵蠶重要活性成分之一，經(jīng)皮接種活蛹生成的僵蛹與僵蠶草酸銨含量相似[10]。另外，臨床上發(fā)現(xiàn)用僵蛹配伍全蝎、蜈蚣、天麻等治療乙型腦炎有高熱抽搐患者的療效與僵蠶相同[11]。如能以僵蛹作為僵蠶的代用品，既解決僵蠶供應(yīng)，又實(shí)現(xiàn)蠶蛹的高值化利用[12]。然而，目前對(duì)僵蛹和僵蠶化學(xué)成分和療效的差異還缺乏全面認(rèn)識(shí)。鑒于此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析僵蛹和僵蠶化學(xué)成分的差異，并比較兩者的抗驚厥作用，為僵蛹作為僵蠶的代用品提供更多依據(jù)。

1 材料

僵蛹和僵蠶由本實(shí)驗(yàn)室人工生產(chǎn)獲得。白僵菌菌株為球孢白僵菌BeauveriabassianaJC-1，家蠶品種為四元雜交種“兩廣二號(hào)”。將白僵菌孢子液分別噴體感染5齡起蠶和化蛹第4天的蠶蛹，自然死亡后繼續(xù)僵化10 d后采收，100 ℃處理0.5 h使病原全部失活，后經(jīng)60 ℃烘干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)<13%，粉碎后過100目篩備用[13]。

Waters Q-TOF Premier飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國沃特世公司)；TYSP-100高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；真空抽濾機(jī)(鞏義市予華儀器有限公司)；小鼠灌胃針(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；甲酸、甲醇(賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取100 mg樣品，加1 mL溶劑(甲醇∶水=8∶2)，冰水浴超聲處理5 min，冷凍離心(4 ℃，16 000 g)15 min，取上清液。重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.2 提取物制備 稱取僵蛹粉或僵蠶粉100 g，熱水回流提取2次，每次1 h，提取液過濾后真空濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得僵蛹水提物或僵蠶提取物，用于抗驚厥小鼠實(shí)驗(yàn)。

2.3 分析方法 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-0.1%甲酸甲醇(B)(0～0.5 min，2%B；0.5～1.5 min，2%～40%B；1.5～9.5 min，40%～80%B；9.5～13 min，80%～100%B；13～13.4 min，100%～2%B；13.4～15.5 min，2%B)，梯度洗脫；體積流量0.38 mL/min；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量3 μL。采用ES+模式；離子源溫度115 ℃；毛細(xì)管電壓3 000 V；脫溶劑氣溫度350 ℃；氣體體積流量600 L/h；錐孔電壓35 V；錐孔氣體積流量50 L/h。質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000，質(zhì)譜掃描時(shí)間為0.3 s，掃描間隔為0.02 s。

2.4 數(shù)據(jù)處理 通過Mass Lynx 4.1軟件包的Data Bridge軟件將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為Net CDF格式，在R軟件中采用XCMS和CAMERA軟件包對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理，用Excel軟件對(duì)所有樣品進(jìn)行歸一化，將歸一化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析。采用Welch’s t test對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)，而對(duì)于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用Wilcoxon Mann-Whitney test進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2.5 差異化學(xué)成分鑒定 根據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的變量重要投影(VIP)>1并結(jié)合非參數(shù)檢驗(yàn) Mann-Whitney U test 的P<0.05來篩選差異化學(xué)成分?；谧越〝?shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜的精確m/z并輔助二級(jí)質(zhì)譜碎片信息對(duì)差異化學(xué)成分進(jìn)行定性并基于標(biāo)準(zhǔn)品或文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)部分差異成分進(jìn)行確認(rèn)。脂類成分通過和脂質(zhì)理論庫比對(duì)后獲得。

2.6 小鼠分組與給藥 雄性SPF級(jí)昆明小鼠，18～22 g。購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，然后將小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組、模型組、僵蛹組和僵蠶組，每組10只。用無菌水將水提物溶解，給藥組按照預(yù)設(shè)劑量(生藥20 g/kg)灌胃給藥，對(duì)照組和模型組給予等體積的無菌水，連續(xù)灌胃5 d。第6天給藥30 min，除對(duì)照組外，各組小鼠均腹腔注射1.6 mg/kg士的寧注射液。

2.7 小鼠驚厥反應(yīng)觀察 持續(xù)觀察30 min，記錄小鼠的陣攣潛伏期(Ⅰ-Ⅲ級(jí)的發(fā)作時(shí)間)、強(qiáng)直性驚厥潛伏期(Ⅴ級(jí)發(fā)作)和30 min內(nèi)小鼠死亡的只數(shù)，通過視頻監(jiān)控小鼠癇性發(fā)作過程。小鼠驚厥反應(yīng)的觀察參照Racine標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)無反應(yīng)；Ⅰ級(jí)節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動(dòng)陣攣；Ⅱ級(jí)點(diǎn)頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動(dòng)陣攣；Ⅲ級(jí)出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立；Ⅳ級(jí)前肢陣攣伴隨直立；Ⅴ級(jí)全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作而跌倒[14]。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分 僵蛹和僵蠶的UPLC-Q-TOF-MS基峰強(qiáng)度(BPI)色譜圖見圖1。采用PCA無監(jiān)督模式識(shí)別對(duì)僵蛹和僵蠶樣品的差異進(jìn)行分析。從PCA 模型(圖2A)可以看到，僵蛹和僵蠶樣品有明顯的區(qū)分，僵蠶組內(nèi)樣品間的變異性稍大。為了達(dá)到最大化分離和尋找差異性成分，建立有監(jiān)督模式識(shí)別方法OPLS-DA模型(圖2B)，發(fā)現(xiàn)僵蛹與僵蠶分別處于左右兩側(cè)，說明兩組樣品能被顯著區(qū)分。結(jié)果表明僵蛹和僵蠶在化學(xué)成分上存在顯著差異。

3.2 差異化學(xué)成分鑒定與分析 尋找貢獻(xiàn)值較大的變量，OPLS-DA 載荷圖結(jié)合VIP>1及P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異化學(xué)成分。共篩選出46種差異化學(xué)成分。由表1可知，19種化學(xué)成分含量顯著減少，其中脂類物質(zhì)有11種，為甘油三酯(TG)與山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷、山柰酚、桑色素等3種黃酮類。27種化學(xué)成分含量顯著增多，其中脂類物質(zhì)有20種，主要為甘油二酯(DG)、單酰甘油(MG)、磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和游離脂肪酸(FFA)，以及甜菜堿、腺嘌呤、L-左旋肉堿、膽堿、乙酰肉毒堿等。

表1 僵蛹和僵蠶差異性化學(xué)成分

注：a為標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，b為數(shù)據(jù)庫比對(duì)，c為文獻(xiàn)報(bào)道。差異倍數(shù)計(jì)算方法為兩組數(shù)據(jù)均值之比的對(duì)數(shù)，正值表示該物質(zhì)在僵蛹中的水平高于僵蠶，負(fù)值則相反。

3.3 僵蛹和僵蠶抗驚厥效果比較 通過士的寧致癇小鼠模型對(duì)僵蛹和僵蠶水提物的抗驚厥效果進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。與模型組比較，僵蠶水提物能夠延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期(P<0.01)，提高小鼠的死亡保護(hù)率。僵蛹水提物能夠延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期(P<0.01)，還可以提高小鼠的死亡保護(hù)率(P<0.001)。30 min內(nèi)僵蠶組和僵蛹組分別有2只和3只小鼠未出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣反應(yīng)，兩組其它小鼠平均強(qiáng)直潛伏期較模型組均延長。僵蛹和僵蠶水提物均有抗驚厥作用，且僵蛹水提物對(duì)士的寧致癇小鼠的治療效果更好。

表2 僵蛹和僵蠶對(duì)士的寧致癇小鼠效果

4 討論

2018年全國蠶繭產(chǎn)量67.9萬噸，估算每年的蠶蛹產(chǎn)量在50萬噸以上。由于一直將蠶蛹作為繅絲工業(yè)的副產(chǎn)品，蠶蛹資源未得到很好地利用[9,11]。有報(bào)道僵蛹可以作為僵蠶的代用品，但由于對(duì)僵蛹和僵蠶化學(xué)成分差異缺乏整體了解，對(duì)僵蛹的抗驚厥效果研究較少，僵蛹作為中藥材僵蠶的代用品尚未得到足夠的認(rèn)可。UPLC-Q-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的具有高效分離和定性檢測綜合能力的分析方法，在中藥化學(xué)成分分析等研究中已得到較多應(yīng)用[15-17]。

PCA和OPLS-DA分析結(jié)果表明，僵蛹和僵蠶的化學(xué)成分存在顯著差異，僵蛹中TG含量減少，DG、PC、LPC和FFA含量增多。與白僵菌將蠶(蛹)體脂肪水解為游離脂肪酸供其生長所需有關(guān)[18]。此外，山奈酚、山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷和桑色素等黃酮類成分含量下降。山柰酚、槲皮素和桑色素等是蠶體中主要的黃酮類物質(zhì)，來自于桑葉黃酮在蠶體中的積累[19]。山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷是僵蠶僵化反應(yīng)的特征成分，白僵菌能夠以蠶體中的山柰酚為底物發(fā)生4-O-甲基葡萄糖苷化反應(yīng)，生成山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷[20]。另外，僵蛹中甜菜堿、腺嘌呤、L-左旋肉堿和膽堿成分含量有所增加。

通過士的寧致癇模型小鼠對(duì)僵蛹和僵蠶抗驚厥效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)僵蛹和僵蠶水提物均有抗驚厥作用，且僵蛹水提物在延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期和提高小鼠死亡保護(hù)率方面的效果更好。為僵蛹作為僵蠶代用品提供了重要理論依據(jù)。