林 紅， 張 玲

(連云港市中醫(yī)院藥學部，江蘇 連云港 222004)

支氣管哮喘是由多種細胞(如氣道上皮細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等)參與的氣道慢性炎性反應，臨床特征主要為可逆性氣道阻塞、氣道重建、氣道高反應性[1-2]。隨著環(huán)境污染的加重，支氣管哮喘發(fā)病率及病死率逐年攀升，嚴重威脅現(xiàn)代人類健康。近年來，中醫(yī)藥在哮喘病理生理、實驗研究中取得了一定進展，且不少中藥在哮喘治療過程中發(fā)揮良好效果[3-4]。南葶藶子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為十字花科植物播娘蒿DescurainiaSophia(L.)Webb ex Prantl的干燥成熟種子，具有行水消腫，瀉肺平喘之功效?，F(xiàn)代研究表明，葶藶子總黃酮有拮抗血小板激活因子作用[5]，并對大鼠氣道平滑肌細胞增殖有抑制作用[6]。以葶藶子為君藥的復方蠲哮湯為治療哮喘痰瘀伏肺的安全有效方劑[7]。盡管不少研究表明南葶藶子提取物對哮喘有一定治療效果，但具體作用機制研究尚不明確。以往研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)信號通路介導的細胞因子和炎性遞質[8]，以及CyclinD1具有誘導平滑肌細胞增殖的作用[9]。因此，本研究通過檢測南葶藶子提取物對哮喘大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達、PI3KmRNA表達的影響，以期探究南葶藶子提取物對哮喘大鼠的起效機制。

1 材料

1.1 動物 100只SPF 級SD雄性大鼠，10周齡，體質量(200±20)g，購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2015-0001。

1.2 試劑與藥物 南葶藶子，由連云港市中醫(yī)院藥學部副主任中藥師林紅鑒定為正品。卵蛋白(美國Sigma公司)；PI3K引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；山羊血清、氯化三苯基四氮唑、蘇木素均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 RM2235型石蠟切片機(德國Leica公司)；BC-20 S型全自動血細胞計數(shù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；X100型電子顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；PRISM 7000型Real time PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 南葶藶子提取物制備 取200 g南葶藶子，打粉過篩后，加8倍量蒸餾水于70 ℃提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，即得南葶藶子水提物；另取200 g南葶藶子，打粉過篩后，加8倍量75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，旋蒸至無醇味，定容至100 mL，即得南葶藶子醇提物。

2.2 分組及造模 參考文獻[10]報道，大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、地塞米松組、南葶藶子醇提物組、南葶藶子水提物組，每組20只。除空白組外，其余各組均建立哮喘模型。實驗第1、8天腹腔注射1 mL 10%卵蛋白致敏，自第15天起，每天以1%卵蛋白霧化30 min進行激發(fā)，同時每天將大鼠放入0～2 ℃寒冷箱中2 h，共持續(xù)7 d，直至大鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌抽搐、呼吸急促、站立不穩(wěn)、畏寒肢冷等癥狀，并取各組大鼠肺泡灌洗液，低速離心，PBS重懸，經(jīng)涂片、染色后計數(shù)細胞總數(shù)，并計算其中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞百分比，若上述各指標升高，符合炎性改變, 則認為哮喘模型建立成功?？瞻捉M用生理鹽水代替卵蛋白進行致敏、激發(fā)，不用寒冷刺激。

2.3 給藥 各給藥組均于造模開始第21天灌胃給藥，地塞米松組給予0.4 mg/kg地塞米松片(研碎后溶于生理鹽水)，南葶藶子水提物、醇提物組給予南葶藶子水提物、醇提物 10 g/kg，空白組和模型組給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。灌胃期間，大鼠自由進食、飲水，每周稱定體質量1次，根據(jù)體質量變化調整給藥量。

2.4 免疫組化法檢測肺組織中CyclinD1蛋白表達 大鼠于給藥前和末次給藥后禁食12 h后取材。參考文獻[11]報道，大鼠以10%水合氯醛麻醉后，斷頭處死，取左上肺，浸泡在10%甲醛溶液中固定，密封好并標記，剩余肺組織液氮凍存。制作石蠟切片后，常規(guī)脫蠟，滴加3%過氧化氫室溫靜置15 min，PBS洗滌3次，加山羊血清封閉液孵育30 min，加一抗4 ℃孵育過夜，次日加生物素標記的二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色10 min，PBS洗滌3次，蘇木素復染，光學顯微鏡400倍下觀察CyclinD1分布強度，其中細胞質或細胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性，采用陽性細胞半定量分級法統(tǒng)計染色結果，計算百分率。

2.5 RT-qPCR法檢測大鼠肺組織中PI3KmRNA表達 參考文獻[12]報道，取適量肺組織，采用TRIzol法提取總RNA，通過HD-3000核酸蛋白檢測(上海楚定分析儀器有限公司)確定總RNA純度與濃度，若純度比值在1.8～2.0間認為純度適合。按照Bestar qPCR RT Kit說明書，以1 g總RNA為模板反轉錄為cDNA。PI3K正向引物序列5′-AAGAAGCTGAACGAATGGTTG-3′，反向引物序列5′-GGTGGCAGTCTTGTTGATGAC-3′，PCR擴增反應條件為95 ℃保持5 min，94 ℃保持30 s，55～65 ℃保持30 s，72 ℃保持1 min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCT法計算PI3KmRNA相對表達量。

3 結果

3.1 南葶藶子提取物對大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞比例的影響 給藥前，模型組及各給藥組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞比例均高于空白組(P<0.05)；給藥后，各給藥組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞比例均低于給藥前(P<0.05)，且低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 南葶藶子提取物對大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞比例的影響

3.2 南葶藶子提取物對大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達的影響 給藥前，模型組及各給藥組大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達均高于空白組(P<0.05)；給藥后，各給藥組大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達均低于給藥前(P<0.05)，且低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 南葶藶子提取物對大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達的影響

3.3 南葶藶子提取物對大鼠肺組織中PI3KmRNA表達的影響 給藥前，模型組及各給藥組大鼠肺組織中PI3KmRNA表達均高于空白組(P<0.05)；給藥后，各給藥組大鼠肺組織中PI3KmRNA表達均低于給藥前(P<0.05)且低于模型組(P<0.05)，見表3。

表3 南葶藶子提取物對大鼠肺組織中PI3K mRNA表達的影響

4 討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)學“哮病”范疇，中醫(yī)理論認為哮病因“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰” 所致，其中“痰瘀伏肺”為哮喘的根本原因[13-14]，不少醫(yī)者采用治痰瘀的中藥改善哮喘癥狀。本研究選用的南葶藶子是痰瘀伏肺良藥，但其具體作用機制尚不明確。

以往研究表明，CyclinD1在正常細胞中與細胞增殖有關，能夠促進細胞周期[15-16]。在大鼠肺發(fā)育過程中，CyclinD1集中表達于氣道平滑肌細胞中，在調節(jié)細胞G1期向S期轉變過程中起關鍵作用[17]。不少研究證實，氣道平滑肌細胞增殖是哮喘發(fā)生的重要機制之一[18-19]。因此，下調CyclinD1表達，對影響氣道平滑肌細胞增殖，改善氣道重塑有直接作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織中CyclinD1表達高于空白組；南葶藶子提取物可降低肺組織中CyclinD1表達；此外，南葶藶子提取物組與地塞米松組給藥后CyclinD1表達組間差異無統(tǒng)計學意義，說明兩者對CyclinD1表達的下調作用相當。

PI3K信號通路參與氣道平滑肌細胞增殖過程，PI3KmRNA通過介導細胞因子、炎性遞質、生長因子等促進氣道平滑肌細胞增殖，因此，PI3K信號通路在哮喘氣道重塑及哮喘氣道高反應性過程中發(fā)揮重要作用[20-21]。本研究結果顯示，模型組給藥前肺組織中PI3KmRNA表達高于空白組，提示哮喘發(fā)生時肺組織PI3KmRNA處于激活水平；南葶藶子提取物可降低肺組織中PI3KmRNA表達；南葶藶子提取物PI3KmRNA表達與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示南葶藶子提取物對PI3KmRNA抑制作用與地塞米松相當。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同方法提取的南葶藶子提取物對哮喘大鼠肺組織中CyclinD1蛋白表達、PI3KmRNA表達抑制效果相似，提示醇提取法和水提取法對南葶藶子有效成分的影響相差較小。

綜上所述，南葶藶子提取物可以有效抑制哮喘大鼠肺組織中CyclinD1蛋白、PI3KmRNA表達，抑制氣道平滑肌細胞增殖，從而起到抑制氣道重塑的作用。