楊小四， 姚文兵， 胡華麟， 劉 毅

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，安徽 安慶 246052；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 安慶 246052)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于多關(guān)節(jié)累積的滑膜炎性病變，炎癥刺激關(guān)節(jié)滑膜增生，新生血管形成，但確切病因未明[1]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路異常參與滑膜炎癥，針對該信號通路設(shè)計藥物靶點是目前治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個關(guān)注方向[2-3]。目前，臨床類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中常用的抗風(fēng)濕藥、非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等均有一定局限性，生物制劑大多價格昂貴[4-5]。天然中草藥提取物因其在抗風(fēng)濕中具有一定療效，價廉且副作用小而廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療[6]。毛莨科植物牡丹皮的提取物丹皮酚具有消炎作用，有文獻(xiàn)報道，其對實驗動物關(guān)節(jié)炎有抑制作用，可以抑制致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]，但其機制并不確定。佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型為免疫性關(guān)節(jié)炎性模型，其病程中動物表現(xiàn)的癥狀和病理變化類似于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，被廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究[8]。本研究通過構(gòu)建佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表達(dá)的影響，探討丹皮酚改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)功能的部分機制，為中藥丹皮酚治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±10)g，購買并飼養(yǎng)于安徽省動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2017-001，每籠5只，飼養(yǎng)環(huán)境為相對濕度(50±5)%，溫度(25±2)℃，采取燈光照明，明暗12 h/12 h交替，飼喂顆粒食用飼料，自由飲水。本實驗經(jīng)安徽省動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查號AH.20190903c0600105)。

1.2 試劑與藥物 丹皮酚(純度>99%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號552-41-0)。p38 MAPK抑制劑SB203580(美國Cayman公司，批號13067-5)；弗氏完全佐劑(freunds complete adjuvant，F(xiàn)CA)(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號F5881)；水合氯醛(山東濟南嘉格生化科技有限公司，批號312-07-3)；大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司，批號KB1822、KB3911、KB2720)；蘇木精(北京索萊寶科技有限公司，批號H8070)；TRIzol(美國Invitrogen公司，批號19206038)；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Gene Copoeia公司，批號2037901801)；羊抗鼠p38 MAPK抗體、羊抗鼠β-actin抗體(美國Santa Cruz公司，批號SC00238、SC69879)；二抗兔抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白(Ig)G(北京華美生物技術(shù)公司，批號2020-07-29)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號AR0146)。

1.3 儀器 病理切片機(德國Leica公司，型號RM2235)；高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司，型號55362R)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號olympusix71)；酶標(biāo)儀(美國Wisdom公司，型號6500)；實時熒光定量PCR儀(德國Roche 公司，型號LightCycler96)。

2 方法

2.1 動物分組、造模、給藥及標(biāo)本處理 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表分為對照組(10只)和佐劑性關(guān)節(jié)炎造模組(50只)。佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型制備依據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，在大鼠左后肢足趾皮下注射FCA 0.1 mL，對照組注射等容量生理鹽水。致炎12 d后，50只造模組再隨機均分為模型組(生理鹽水)，丹皮酚低、中、高劑量組(8、16、32 mg/kg)，SB203580 組(2 mg/kg)，每組10只，灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，對照組灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)16 d。腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，抽取5 mL股動脈血，6 000 r/min離心10 min，分離得到血清，于-20 ℃冰箱保存。每組取3只大鼠踝關(guān)節(jié)做形態(tài)學(xué)研究，另7只踝關(guān)節(jié)滑膜組織作分子生物學(xué)研究。

2.2 繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎的癥狀判定 根據(jù)課題組前期報道[10]，致炎12 d開始，每4 d觀察并記錄繼發(fā)性關(guān)節(jié)改變情況。主要觀察指標(biāo)為①關(guān)節(jié)腫脹度，采用容積測量儀，排水法檢測大鼠右后肢(非致炎側(cè))踝關(guān)節(jié)容積改變，公式為踝關(guān)節(jié)容積改變(ΔmL)=致炎后右后肢容積-致炎前右后肢容積。②關(guān)節(jié)炎指數(shù)，采用雙盲法三人觀察計分，計算除致炎側(cè)外其它關(guān)節(jié)情況，0分，關(guān)節(jié)無明顯結(jié)構(gòu)變化；1分，某1個肢體關(guān)節(jié)輕微腫脹或有紅斑；2分，≥2個肢體關(guān)節(jié)輕微腫脹或有紅斑；3分，≥2個肢體關(guān)節(jié)腫脹或紅斑；4分，≥2個肢體關(guān)節(jié)明顯腫脹，站立不穩(wěn)，計算3個關(guān)節(jié)累計得分，最高12分。

2.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子水平 取大鼠血清，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品和檢測溶液，根據(jù)操作步驟檢測血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平，酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的吸光度(A)值。

2.4 踝關(guān)節(jié)p38 MAPK單克隆抗體免疫組化病理學(xué)檢查 10%福爾馬林充分固定踝關(guān)節(jié)后，經(jīng)脫鈣、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，得到石蠟切片，脫蠟后微波抗原修復(fù)，H2O2室溫避光作用以消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗羊抗鼠p38 MAPK單克隆抗體(1∶300)50 μL，4 ℃孵育過夜，次日滴加50 μL兔抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白(Ig)G二抗染液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片后鏡檢，陰性對照采用PBS代替一抗染色，細(xì)胞質(zhì)(或核)呈黃色或棕黃色為陽性顯色。采集圖像，南京捷達(dá)JD80i軟件分析圖像，參照文獻(xiàn)[10]報道計算p38 MAPK陽性細(xì)胞吸光度(A)值。

2.5 RT-qPCR檢測p38MAPKmRNA表達(dá) 取凍存大鼠滑膜組織塊并剪碎，采取TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度。嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，p38MAPK正向序列5′-CGGTGTGTGCT GCTTTTGAT-3′，反向序列5′-CTGTAGCTTCCTTTTGGCGTG-3′；β-actin正向序列 5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，反向序列5′-GTTGGCATAGGTCTTTACGG-3′。RT-qPCR反應(yīng)體系共20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)45次。熔解曲線反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，冷卻。實驗結(jié)果以2-ΔΔCT法表示。

2.6 Western blot檢測p38 MAPK蛋白表達(dá) 取凍存大鼠滑膜組織塊并剪碎行，加入10倍體積蛋白裂解液，充分裂解后提取滑膜組織中總蛋白，采取BCA法檢測蛋白濃度，然后加入蛋白上樣緩沖液，水浴鍋煮沸加熱3～5 min，冷卻后定量并制備上樣液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉液中室溫?fù)u床封閉30 min，加入一抗p38 MAPK(1∶1 500)、β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗(1∶3 000)37 ℃孵育30 min，顯影與曝光，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的影響 與對照組比較，致炎12 d(給藥前)后，模型組大鼠繼發(fā)性足腫脹度增加(P<0.01)；與模型組比較，致炎16 d(給藥4 d)后，丹皮酚各劑量組和SB203580組均可抑制大鼠繼發(fā)性足腫脹(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高劑量組作用更為明顯，見圖1。

3.2 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 與對照組比較，致炎12 d(給藥前)后，模型組大鼠非致炎側(cè)足趾開始腫脹，隨免疫時間延長而加重，直至大鼠站立困難，各時間點關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分升高(P<0.01)；與模型組比較，致炎16 d(給藥4 d)后，丹皮酚各劑量組和SB203580組均有效改善癥狀，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分降低(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高劑量組降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)更明顯，見圖2。

3.3 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎癥因子水平的影響 與對照組比較，模型組血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)，見圖3。

3.4 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響 對照組有少量p38 MAPK蛋白陽性表達(dá)；與對照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織增厚，p38 MAPK蛋白陽性表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p38 MAPK蛋白陽性表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量的增加，p38 MAPK蛋白陽性表達(dá)下降，見圖4、表1。

表1 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響

3.5 丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，見圖5。

4 討論

中藥制劑在藥理中常具有多靶點、高安全性等優(yōu)點，雷公藤多苷片[11]、青藤堿[12]、丹皮酚等抗炎、鎮(zhèn)痛作用顯著，常用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。丹皮酚是中藥丹皮的提取物，具有涼血清熱、活血化瘀作用，文獻(xiàn)報道其有鎮(zhèn)痛、抗炎、清除自由基、抗氧化、抗過敏、解熱、抗腫瘤等多種功效[13]。本研究采取FCA局部注射大鼠足趾皮下構(gòu)建佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，是一種常見的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型，通過探究丹皮酚對佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響，為丹皮酚在臨床上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。研究表明，與模型組比較，第16、20、24、28天時，丹皮酚各劑量組大鼠繼發(fā)性足腫脹程度和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分呈劑量依賴性降低，表明丹皮酚可有效抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠繼發(fā)性炎癥，降低關(guān)節(jié)腫脹癥狀，且呈劑量依賴性。

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，患者體內(nèi)細(xì)胞免疫系統(tǒng)活化，激活單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，導(dǎo)致血清炎細(xì)胞分泌改變，IL-1β 和TNF-α等致炎因子水平升高，IL-1β往往作為炎癥的始動因素，刺激滑膜細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨釋放前列環(huán)素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶等，加重滑膜炎癥反應(yīng)，分解骨基質(zhì)[14]; 同時，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的活動進(jìn)展期，由單核-巨噬系統(tǒng)分泌的TNF-α呈高表達(dá)，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，驅(qū)動血液中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位積聚，級聯(lián)機體炎癥反應(yīng)[15]。本研究表明，丹皮酚可調(diào)節(jié)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠中細(xì)胞因子水平，使得致炎因子IL-1β和TNF-α水平降低，抑炎因子IL-10水平升高，從而減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，包括減輕足腫脹，降低腫脹度和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)，延緩佐劑性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程。

近年來，越來越多實驗通過探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理機制而尋求中藥對其有效的治療方法[16]，其中p38 MAPK信號通路是炎性改變的經(jīng)典通路[17-18]。本研究表明，丹皮酚干預(yù)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠16 d后，關(guān)節(jié)和膜組織炎性反應(yīng)顯著改善，關(guān)節(jié)表面滑膜組織和關(guān)節(jié)軟骨組織中p38 MAPK蛋白表達(dá)下降，且在基因和蛋白表達(dá)上均表現(xiàn)出類似的結(jié)果。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK信號通路阻斷劑SB203580可以改善佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，表明丹皮酚可能通過抑制p38 MAPK信號通路而改善佐劑性關(guān)節(jié)炎癥狀。

綜上所述，丹皮酚具有抑制p38 MAPK信號通路，從而抑制炎性因子分泌，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨和骨的作用，且呈劑量依賴性，本研究為丹皮酚治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了新的理論基礎(chǔ)。