吳 江， 馬如媛， 林鵬程

(1.青海民族大學(xué)化工學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007)

斑花黃堇是具有活血散瘀、利氣止痛等功能的罌粟科紫堇屬植物。斑花黃堇的藥用部位為全草，用于清熱解毒、止痛、治熱性傳染病等[1]，主要分布在甘肅西南部、青海西南部、四川西北及西部地區(qū)、西藏東部和中部，適生于海拔4 300～5 300 m青藏高原。因其生境環(huán)境惡劣、分布區(qū)域狹窄、全草采挖等原因，資源面臨瀕危。藏藥廠和藏醫(yī)院已用灰綠黃堇等其他紫堇屬作為替代藥材使用[2]，資源利用雜亂。斑花黃堇藏藥材依賴于原產(chǎn)地采挖，尚無規(guī)?；N植生產(chǎn)。為提高其用藥質(zhì)量，迫切需要建立斑花黃堇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，對斑花黃堇的性狀、基原、顯微特征、薄層色譜、水分、灰分、浸出物、有效成分含量等項(xiàng)進(jìn)行深入研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

Sartorius BS 224 S電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；OLYMPUS BX-51顯微成像儀(日本Olympus公司)；卡瑪數(shù)碼薄層成像儀(瑞士卡瑪公司)；101-A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)；Aglient1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫有限公司)。

硅膠G板(10 cm×20 cm)(青島海洋化工有限公司)。碘化鉍鉀(分析純)(天津百世化工有限公司)；碘化碘鉀(分析純)(天津百世化工有限公司)；水合氯醛(分析純)(天津百世化工有限公司)；異紫堇定堿對照品(上海寶曼生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、磷酸(天津百世化工有限公司)；其他試劑(分析純)。

本研究所用藥材收集不同產(chǎn)地及來源的斑花黃堇藥材共計(jì)8批，經(jīng)過青海民族大學(xué)藥學(xué)院林鵬程教授鑒定為罌粟科植物斑花黃堇CorydalisconspersaMaxim.的草本植物，見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 藥物鑒別

2.1.1 性狀鑒別 本品叢生草本。根子紅色，根莖短，簇生棒狀肉質(zhì)須根，莖發(fā)自基生葉腋，裸露，不分枝?？偁罨ㄐ蝾^狀，多花，花淡黃色，具棕色斑點(diǎn)。苞片菱形，棕褐色，具流蘇狀齒。氣味濃。微苦。

2.1.2 基原鑒定 本品叢生草本，高5～30 cm。根莖短，簇生棒狀肉質(zhì)須根，上部具葉和1～4莖。莖發(fā)自基生葉腋，基部稍彎曲，裸露，其上具葉，不分枝。基生葉多數(shù)，約長達(dá)花序基部；葉柄約與葉片等長，基部鞘狀寬展；葉片長圓形，二回羽狀全裂；一回羽片2～8對，對生或近對生；二回羽片常僅3枚，三深裂，裂片橢圓形或卵圓形，約長3～4 mm，寬2 mm，較密集，常呈覆瓦狀疊壓。莖生葉多數(shù)，與基生葉同形，較小?？偁罨ㄐ蝾^狀，長2～4 cm，寬2～2.5 cm，多花、密集；花近俯垂。苞片菱形或匙形，下部的長6～8 mm，寬度常大于長度，邊緣紫色，全緣或頂端具嚙蝕狀齒?；ü４侄?，長約5 mm。萼片菱形，棕褐色，具流蘇狀齒。花淡黃色或黃色，具棕色斑點(diǎn)。上花瓣長1.5～2 cm，具淺雞冠狀突起；距圓筒形，鉤狀彎曲；蜜腺體約貫穿距長的1/2。下花瓣與上花瓣相似，爪較長。內(nèi)花瓣具高而伸出頂端的雞冠狀突起；爪細(xì)長。約長于瓣片2倍。雄蕊束披針形。柱頭近扁四方形，頂端2淺裂，具8乳突。蒴果長圓形至倒卵圓形，約長1 cm，寬4 mm。

2.1.3 顯微鑒別 本品粉末為黃棕色或灰綠色。葉表皮細(xì)胞表面觀呈多角形，垂周壁波狀彎曲且連珠狀增厚。葉表面氣孔不定式?；ǚ哿ｎ悎A形，表面具有網(wǎng)狀紋理。纖維大多成束，細(xì)長且壁厚。木栓細(xì)胞壁厚，表面觀呈類多角形。非腺毛單細(xì)胞，壁厚。導(dǎo)管主要為梯形導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管。顯微特征圖見圖1～8。

2.1.4 薄層鑒別

2.1.4.1 對照品溶液的制備 取異紫堇定堿對照品，精確稱量，加入甲醇制成0.05 mg/mL的溶液，即得。

2.1.4.2 供試品溶液的制備 取斑花黃堇粉末約2.0 g，精確稱重，加入具塞錐形瓶中，加入氯仿-甲醇-濃氨水(5∶1∶0.1)25 mL，于20 ℃下超聲提取，過濾，蒸發(fā)至干，將殘留物加至1 mL甲醇中，并在25 mL量瓶中用甲醇稀釋至規(guī)定體積。

2.1.4.3 鑒別方法 對照品溶液和供試品溶液各5 μL，將對照品溶液與供試品溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨水(7∶2.5∶3∶1.5∶0.5)的下層溶液，進(jìn)行展開，取出，晾干，噴3% AlCl3乙醇溶液顯色，在110 ℃的熱板上烘烤5 min，在365 nm紫外線燈下觀察。斑花黃堇色譜圖和對照品溶液的色譜圖中的斑點(diǎn)位于相應(yīng)的位置呈現(xiàn)相同的顏色，見圖9。

2.2 藥物檢查 對藥材的常規(guī)檢查可以有效地評價(jià)藥材的優(yōu)劣，對斑花黃堇的水分、總灰分和酸不溶性灰分及浸出物進(jìn)行了檢查[3-4]，旨在建立斑花黃堇的水分檢查、灰分檢查、浸出物檢查的標(biāo)準(zhǔn)限度，可在一定程度上反應(yīng)藥材質(zhì)量。5批斑花黃堇的水分為7.38%～10.30%；總灰分為9.33%～16.20%；酸不溶性灰分為0.67%～3.34%。醇溶性浸出物為5.73%～8.64%；水溶性浸出液為17.73%～ 27.39%。見表2。

表2 測定結(jié)果

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Hypersi BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)(0～45 min，5%～65%A)，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長225 nm；進(jìn)樣體積10 μL。理論板數(shù)按異紫堇定堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。色譜圖見圖10～11。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取1、2、4、6、8、16 μL異紫堇定堿對照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y= 91.363X-19.846，r=0.999 6。異紫堇定堿在0.05～0.8 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測得峰面積RSD為0.41%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分批次在室溫下0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，測得異紫堇定堿RSD為0.81%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6個(gè)樣品，約2 g，在“2.1.4.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣測定。測得斑花黃堇中異紫堇定堿的含量為0.007%，RSD為0.93%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量6個(gè)樣品(約2.0 g)，加入0.05 mg的對照品溶液，在“2.1.4.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積。斑花黃堇中異紫堇定堿的平均加樣回收率為96.40%，RSD為1.13%。

2.3.3.1 樣品含量測定 將收集到的8批斑花黃堇藥材，分批次在“2.1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算斑花黃堇中異紫堇定堿含量，見表3。樣品中的異紫堇定堿含量為0.001%～0.018%。

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

本研究通過性狀特征可有效區(qū)別不同來源及易混淆品種的紫堇屬藏藥，其薄層圖譜斑點(diǎn)清晰可見，分離度好，能夠有效鑒別藥材真?zhèn)巍λ?、灰分、浸出物等?xiàng)進(jìn)行測定，初步確定各限量標(biāo)準(zhǔn)，斑花黃堇的水分含量應(yīng)低于9.0%，總灰分含量應(yīng)低于15.0%，酸不溶性灰分含量應(yīng)低于2.0%，醇溶性浸出物含量應(yīng)高于5.0%，水溶性浸出物含量應(yīng)高于17.0%。利用HPLC法測定異紫堇定堿的含量，各產(chǎn)地斑花黃堇含量差異大。其化學(xué)成分因受海拔、土壤、溫度、光照、水分、坡度等多種生態(tài)因子的影響[5-11]。

綜上所述，本研究方法可作為斑花黃堇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參考，為其人工種植及開發(fā)利用提供質(zhì)量保證。