敬 爽， 鄧麗娟， 李瑞瑞， 宋百靈， 張婷婷， 李新霞*， 李建光*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830011)

大蒜為百合科蔥屬植物蒜AlliumsativumL.的地下鱗莖，是一種藥食兩用植物[1]，具有防止心血管疾病[2]、抗病原微生物[3]、抗氧化[4]等藥理活性。蒜氨酸(S-烯丙基L-半胱氨酸亞砜)是大蒜中特有的含硫氨基酸，被《美國藥典》選為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[5]。

H2S是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號分子，具有重要的生理功能，大蒜為其天然供體，蒜氨酸、S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)等含硫氨基酸均可在體內(nèi)生成它[6]。另外，大蒜中還含有大量其他氨基酸，其中精氨酸、谷氨酰胺含量較高，并且后者為還原型谷胱甘肽(GSH)合成提供前體，而GSH可與含硫氨基酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為H2S[7]；前者是NO合酶底物，而NO可與H2S產(chǎn)生協(xié)同作用保護(hù)心肌[8]。同時，大蒜中也含有大量糖類，多糖可促使免疫性肝損傷患者建立新的免疫平衡，從而保護(hù)肝臟[9]。

蒜氨酸提取工藝放大過程中采用多種途徑進(jìn)行優(yōu)化，提取物中含有多種氨基酸和多糖，故需要將有效成分與藥效相結(jié)合來全面評價并優(yōu)化工藝。本實驗根據(jù)合作企業(yè)優(yōu)化工藝提供的多個提取物，提高特征圖譜結(jié)合多指標(biāo)藥效貢獻(xiàn)率來評價蒜氨酸提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(型號LC-2010AD-SPD-RID)、紫外分光光度計(型號UV-2700)(日本島津公司)；電子分析天平(型號AB135-S，瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 三乙胺(天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司，20110509)；異硫氰酸苯酯(北京百靈威試劑有限公司)；正己烷(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，20150207)；三水醋酸鈉[福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，20140804]。天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蒜氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)、S-甲基-L-半胱氨酸(SMC)、反-4-羥基-L-脯氨酸、L-天冬酰胺(北京百靈威試劑有限公司)。蒜氨酸對照品(新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，批號20160615)。硫酸、蒽酮(分析純)。

1.3 樣品 具體信息見表1。

表1 不同提取工藝下蒜氨酸提取物信息

2 方法與結(jié)果

2.1 氨基酸特征圖譜建立

2.1.1 對照品溶液制備 取各氨基酸對照品適量，制成貯備液，精密量取0.4 mL，加異硫氰酸苯酯、含三乙胺的乙腈溶液各0.2 mL，混勻，40 ℃水浴反應(yīng)40 min，0.8 mL正己烷萃取2次，合并下層溶液，濾過，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取蒜氨酸提取物100 mg，置于10 mL量瓶中，加水至刻度，精密量取0.4 mL，按“2.1.1”項下方法處理，即得。

2.1.3 色譜條件 參考文獻(xiàn)[10]報道，流動相12.6 μg/mL三水醋酸鈉(A)-[甲醇-乙腈-水(2∶6∶2)](B)，梯度洗脫；體積流量1.0 mg/mL；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.4 圖譜生成 取10批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，對照品、供試品溶液典型色譜圖分別見圖1～2。將特征圖譜(圖3)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A)”軟件，經(jīng)校正，圖譜自動匹配后生成對照圖譜，確定并指認(rèn)出11個特征峰。

2.1.5 方法學(xué)考察 取供試品溶液適量，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定5次，測得各特征峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。平行制備6份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測定各特征峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各特征峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 工藝數(shù)值分類結(jié)果

從特征圖譜的模糊性出發(fā)，I1可用于分類鑒別，其數(shù)值越接近，工藝越相似，表2顯示，以3.39為閾值，工藝路線A、B的I1在3.39～3.58范圍內(nèi)，歸為ⅠA類；工藝路線C、D的I1在3.06～3.37范圍內(nèi)，歸為ⅡA類，表明這2類在氨基酸成分組成上具有差異。I2可于品質(zhì)優(yōu)劣比較，其絕對值越高，質(zhì)量越好，表2顯示，不同工藝I2依次為工藝路線D>工藝路線C>工藝路線B>工藝路線A，即工藝路線D最佳，工藝路線A最差；工藝路線A、B得分差異較大，表明兩者氨基酸含量明顯不同；工藝路線C、D得分接近，表明后者雖然優(yōu)于前者，但優(yōu)化效果不明顯。

2.1.7 主成分分析 將10批樣品中蒜氨酸、精氨酸、SAC、谷氨酰胺峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行主成分分析，計算其特征值、方差貢獻(xiàn)率。結(jié)果，特征值分別為2.269、1.049，其中第一主成分F1=0.434X1-0.242X2+0.564X3+0.187X4，方差貢獻(xiàn)率為56.73%，主要反映蒜氨酸、SAC含硫氨基酸在化學(xué)質(zhì)量上的信息；第二主成分F2=0.113X1+0.715X2-0.332X3+0.400X4，方差貢獻(xiàn)率為26.22%，主要反映精氨酸、谷氨酰胺在化學(xué)質(zhì)量上的信息，可知前2個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.95%，基本保留原有變量的全部信息。再計算綜合評分F，公式為F=(56.73F1+26.22F2)/82.95，結(jié)果見表3，由于綜合評分越高，質(zhì)量越好，可知工藝路線D為最佳工藝。

表3 主成分得分及排序

以第1主成分為橫坐標(biāo)，第2主成分為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，見圖4。由此可知，工藝分為3類，工藝路線A、B為Ⅰ類，工藝路線C為Ⅱ類，工藝路線D為Ⅲ類，進(jìn)一步驗證了各工藝下提取物中氨基酸含量有明顯差異。另外，與數(shù)值分類法比較，該方法未將工藝路線C、D歸為一類，可能是由于前者對樣品進(jìn)行歸類時只提取保留時間信息未提取峰面積信息，表明ⅡB類、Ⅲ類雖然氨基酸成分組成一致，但含量有所差異。

2.2 其他氨基酸總量測定 精密稱取100 mg提取物至10 mL量瓶中，按“2.1.2”項下方法衍生化處理，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表4。由此可知，該類成分總含量在4.42%～11.59%范圍內(nèi)，其中精氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺含量較高，約占62%～84%。

表4 有效成分含量及CRITIC評分測定結(jié)果

2.3 蒜氨酸含量測定 結(jié)果見表4。

2.3.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[13]報道，Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.04%三氟乙酸；柱溫35 ℃；檢測波長214 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 線性關(guān)系考察 將蒜氨酸對照品貯備液依次稀釋至26.3、52.6、105.20、157.86、210.48、263.10 μg/mL，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=16 704X-1 724(r=0.999 9)，在26.3～263.1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 總糖含量測定 采用硫酸-蒽酮法，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.009 3X+0.067 5(r=0.996 2)，在3.4～20.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表4。

2.5 TLC鑒別 參考文獻(xiàn)[14]報道，以冰乙酸-氯仿-水(21∶18∶4)為展開系統(tǒng)，果糖、蔗糖、棉子糖為對照，展開后噴苯胺-二苯胺顯色，在白光下檢視，結(jié)果見圖5。由此可知，除工藝路線D外其他工藝路線下提取物均含有果糖，無蔗糖、棉子糖，并且根據(jù)比移值和糖性質(zhì)，可能還含有三糖和四糖，表明工藝路線D中低聚糖成分降低。

為了消除各指標(biāo)量綱不同對貢獻(xiàn)率的影響，需要對各指標(biāo)的數(shù)據(jù)值進(jìn)行無量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理，公式為V標(biāo)準(zhǔn)化=(∣V給藥-V模型∣)/V模型。

根據(jù)前期報道的蒜氨酸、大蒜多糖對化學(xué)性肝損傷中IFN-γ、AST、ALT、肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)變化[14]，構(gòu)建CRITIC權(quán)重模型評價蒜氨酸和多糖分別對化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再計算IFN-γ、AST、ALT、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)權(quán)重系數(shù)，分別為0.129 3、0.294 3、0.072 2、0.341 7、0.162 6，再根據(jù)綜合權(quán)重與各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)值計算綜合加權(quán)效應(yīng)值，結(jié)果見表5，可知大蒜多糖、蒜氨酸藥效貢獻(xiàn)率分別為47.57%、52.42%。

表5 各指標(biāo)效應(yīng)值測定結(jié)果

由于不同有效成分有效劑量差異較大，故采用有效成分藥效貢獻(xiàn)率評價提取工藝時需考慮有效劑量。大蒜多糖、蒜氨酸給藥劑量分別為82、17.5 mg/kg，其單位劑量藥效貢獻(xiàn)率分別為0.58%、3.00%。因此，兩者評價提取工藝各自藥效貢獻(xiàn)率分別為16.20%、83.68%。

2.7 結(jié)果分析 蒜氨酸含量與其他氨基酸總量呈正相關(guān)，與總糖含量呈負(fù)相關(guān)。工藝路線A～C下提取物單糖、低聚糖成分組成相同，可知總糖是上述3種工藝下大蒜多糖藥效貢獻(xiàn)值差異大的原因，并且在提取過程中可能損失最多；工藝路線D中未鑒別出低聚糖等成分，可知單糖、低聚糖是該工藝與其他工藝下提取物大蒜多糖藥效貢獻(xiàn)值差異大的原因。

通過CRITIC權(quán)重法計算蒜氨酸、大蒜多糖對保護(hù)肝臟方面的藥效貢獻(xiàn)率，并將其代入工藝評價體系。結(jié)果，工藝路線D仍為最佳工藝，工藝路線C與該工藝下提取物總糖含量相差21%，但CRITIC評分相近，這是后者蒜氨酸含量達(dá)21.01%，而該成分為保護(hù)肝臟最主要的有效物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

本實驗對不同提取工藝下蒜氨酸提取物工藝評價模式進(jìn)行初步探索，先采用特征圖譜對氨基酸成分進(jìn)行整體表征，將氨基酸、多糖含量測定作為局部表征，為了更全面準(zhǔn)確地評價工藝，首次采用CRITIC權(quán)重法計算蒜氨酸、多糖對化學(xué)性肝損傷保護(hù)作用的藥效貢獻(xiàn)率，以綜合藥效為指標(biāo)。再采用數(shù)值分類法、主成分分析對特征圖譜進(jìn)行分析，其中前者是對全譜圖中的所有峰進(jìn)行全面提取并分析，保留了色譜全部信息，可更加直觀地對不同工藝提取物進(jìn)行定性和定量評價，尤其適合有效成分指認(rèn)較少的特征圖譜質(zhì)量評價；后者對多個指標(biāo)進(jìn)行綜合和簡化后構(gòu)建質(zhì)量評價模型，是目前最常用的統(tǒng)計方法，除了可對全譜圖進(jìn)行分析外，還能對特定目標(biāo)成分進(jìn)行評價，結(jié)果顯示，2種數(shù)模評價結(jié)果一致，表明兩者構(gòu)建的不同提取工藝下蒜氨酸提取物中氨基酸質(zhì)量評價模型可行。

多糖約占大蒜干重的70%，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的成分未必有更強(qiáng)的活性效應(yīng)，前期發(fā)現(xiàn)蒜氨酸雖然占比低，但具有更高的藥理活性，并且該成分與多糖在體內(nèi)協(xié)同作用過程中的各自量效關(guān)系難以確定。本實驗首次采用CRITIC權(quán)重法，將藥效貢獻(xiàn)率代入工藝評價系統(tǒng)中，對不同工藝進(jìn)行評分，結(jié)果與以氨基酸為指標(biāo)的數(shù)值分類法和主成分分析一致，均以工藝路線D最佳。

綜上所述，本實驗建立的多組分?jǐn)?shù)學(xué)模型結(jié)合CRITIC藥效模型可為蒜氨酸提取物質(zhì)量評價提供依據(jù)。