呂 悅， 吳杭莎， 韋飛揚(yáng)， 葛衛(wèi)紅*， 杜偉鋒,2,3*， 李昌煜， 張葉峰

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江 杭州 311401；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，浙江 杭州 311400；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州 310053；5.寧波市中藥飲片有限公司，浙江 寧波 315000)

黃精是我國(guó)應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥[1]。黃精含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿、木脂素[2-4]類(lèi)化合物，其中多糖、皂苷類(lèi)成分含量較高，為發(fā)揮藥效作用的主要成分，有抗疲勞、抗氧化、降血糖血脂等作用[5-6]，可作為體現(xiàn)黃精飲片質(zhì)量的指標(biāo)。5-羥甲基糠醛[7]為黃精炮制后產(chǎn)生的化合物且含量變化巨大，其使用安全風(fēng)險(xiǎn)和治療保健功效存在爭(zhēng)議。因不同產(chǎn)地的黃精配方顆粒中5-羥甲基糠醛含量差異較大也將其列為主要成分[8]。2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)黃精含量測(cè)定項(xiàng)下的指標(biāo)為多糖，而黃精炮制前后多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量都發(fā)生變化[9-11]。目前，黃精飲片常用色譜法開(kāi)展質(zhì)量評(píng)價(jià)，包括薄層色譜、高效液相色譜法、指紋圖譜和液質(zhì)聯(lián)用法等手段[12-13]。基于綠色化學(xué)可持續(xù)發(fā)展理念，創(chuàng)新中藥提取分析方法，構(gòu)建綠色中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，建立一種快速無(wú)損，簡(jiǎn)便可靠的黃精飲片多指標(biāo)定量方法尤為重要。

近紅外光譜分析技術(shù)是通過(guò)照射紅外光得到樣品吸收光譜，反應(yīng)樣品中分子振動(dòng)能級(jí)躍遷的信息，目前已廣泛應(yīng)用于食品、中藥材真?zhèn)舞b別、產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量定量分析方面[14-15]，是一種有效的質(zhì)量控制和鑒別技術(shù)，有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、高靈敏度等特點(diǎn)，且在多種藥材有所應(yīng)用，如延胡索、片姜黃、薏苡仁[16-18]等。在此基礎(chǔ)上，本研究首次利用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行黃精飲片的質(zhì)量控制，通過(guò)收集大量不同產(chǎn)地黃精飲片，以多糖、皂苷和5-羥甲基糠醛含量為黃精活性成分代表，采集所有樣品的近紅外光譜圖，結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立黃精飲片多指標(biāo)近紅外定量模型，以期實(shí)現(xiàn)黃精飲片質(zhì)量快速評(píng)價(jià)及控制。

1 材料

Antaris Ⅱ型傅立葉變換近紅外光譜儀、TQ Analyst 8.3.125分析軟件、U3000高效液相色譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司)；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；NT-xs105電子分析天平(0.01 mg，瑞士 Mettler Toledo公司)；DFD-700電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；MIL-SYN型超純水儀(美國(guó)Milipore公司)。

無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%，批號(hào)G6172-500)、人參皂苷Rb1(純度99%，批號(hào)110704-202129)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，批號(hào)B21832)購(gòu)自上海源葉生物有限公司；乙醇、二氯甲烷均為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

138批黃精分別購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片有限公司、安徽亳州千草國(guó)藥、山東博康藥業(yè)、河北春開(kāi)制藥等16家國(guó)內(nèi)中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定 按2020年版《中國(guó)藥典》中黃精含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定。以多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)，得到回歸方程A=20.682X+0.011 9(R2=0.998 9)，在0.003 1～0.023 2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為0.43%、1.07%、0.36%；平均加樣回收率100.87%。

2.2 皂苷含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取黃精粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，加入80%乙醇25 mL，每個(gè)樣品平行3份。60 ℃超聲60 min，重復(fù)提取2次，過(guò)濾，合并濾液至50 mL量瓶中，用80%乙醇定容。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，甲醇溶解，得1.0 mg/mL對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL于試管中揮干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻，在60 ℃水浴保溫15 min后，冰浴2 min，加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻，靜置5 min[19]。以相應(yīng)試劑為空白，于568 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。以人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)，得到回歸方程A=13.704X-0.015 9(R2=0.995 2)，在0.009 9～0.070 3 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法學(xué)考察 精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.78%。取同一批樣品，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別于0、5、10、20、40、60 min測(cè)定，RSD為1.35%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。取同一批樣品，按“2.2.1”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，RSD為0.61%，表明方法重復(fù)性良好。取已知皂苷含量的黃精樣品粉末6份，每份0.5 g，精密加入人參皂苷Rb1對(duì)照品，測(cè)定平均加樣回收率為99.83%，RSD為1.12%。

2.2.4 含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液0.1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算皂苷含量。

2.3 5-羥甲基糠醛含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱取樣品1 g于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL二氯甲烷，超聲60 min，放冷，補(bǔ)重。精密吸取10 mL，蒸干，殘?jiān)尤爰状既芙猓D(zhuǎn)移置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm濾膜即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取19.37 mg 5-羥甲基糠醛于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，精密吸取上述溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容置刻度，搖勻，即得0.193 7 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.3.3 色譜條件 Agilent ZORBAX-Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～16 min，7%A；16～17 min，7%～20%A；17～40 min，20% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min[20]。色譜圖見(jiàn)圖1，各峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、30 μL測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程Y=45 317X+1.179 7(R2=0.999 3)，在0.000 1～0.005 8 μg范圍線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，在“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)下方法分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，RSD為0.72%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，在“2.3.1”項(xiàng)方法平行制備6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，RSD為1.68%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量黃精粉末6份，每份1 g，精密加入5-羥甲基糠醛對(duì)照品在“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定平均加樣回收率為99.12%，RSD%為0.74%。

2.4 近紅外光譜采集 將138批黃精粉碎后過(guò)5號(hào)篩，取約10 g于石英杯中攤平，以內(nèi)置背景做參比扣除，采集光譜圖。采樣方式積分漫反射，波數(shù)區(qū)間3 999～10 001 cm-1，分辨率8.0 cm-1。室溫23～27 ℃，重復(fù)掃描3次，取其平均光譜，見(jiàn)圖2。

2.5 校正集與驗(yàn)證集的劃分 從138批黃精中隨機(jī)選取16批作為驗(yàn)證集，122批作為校正集，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 校正集與驗(yàn)證集的含量測(cè)定結(jié)果

2.6 近紅外光譜預(yù)處理 定量模型的校正算法有逐步多遠(yuǎn)線性回歸法(SMLR)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回歸法(PCR)。對(duì)于組分復(fù)雜的中藥，多選用PLS[21-22]。以相關(guān)系數(shù)、均方差、預(yù)測(cè)均方差為考察指標(biāo)進(jìn)行考察，其中相關(guān)系數(shù)越接近1，均方差、預(yù)測(cè)均方差越接近0，模型預(yù)測(cè)精密度越好。首先通過(guò)多元信號(hào)校正(MSC)或標(biāo)準(zhǔn)正則變換(SNV)對(duì)由于樣品顆粒和分布不規(guī)則引起的偏差進(jìn)行消除，減少光散射或光程差造成的影響[23]；再通過(guò)原始光譜、一階求導(dǎo)(1std)或二階求導(dǎo)(2std)減輕光譜基線漂移；最后用無(wú)平滑(NS)、卷積平滑濾波(S-G)或者Norris導(dǎo)數(shù)平滑濾波(Nd)處理方法提高信噪比、減小隨機(jī)誤差[24]，見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛分別選擇MSC+1stD+NS、MSC+Spectrum+S-G、MSC+1stD+S-G方法處理時(shí)，相關(guān)參數(shù)最優(yōu)，因此選用此方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理。

表2 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)校正模型的影響

2.7 波段選擇 以性能指數(shù)為指標(biāo)，通過(guò)TQ Analyst軟件優(yōu)化，選擇最適宜分析的光譜波段，見(jiàn)表3，得到多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛最優(yōu)波段分別為5 149.01～4 720.89、5 850.97～5 800.83、4 898.31～4 184.77、9 931.6～8 280.84 cm-1，模型預(yù)測(cè)精密度良好。

表3 不同光譜范圍的影響

2.8 主因子數(shù)選擇 通過(guò)PLS建立定量模型時(shí)，主因子數(shù)的數(shù)量會(huì)影響定量模型的精密度。主因子數(shù)過(guò)少可能會(huì)導(dǎo)致精密度降低，主因子數(shù)過(guò)多可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)擬合現(xiàn)象。通過(guò)預(yù)測(cè)殘差平方和以及內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)篩選主因子數(shù)，考察主因子數(shù)對(duì)多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛的影響，結(jié)果表明最佳主因子數(shù)分別為6、9、5時(shí)模型的RMSECV最小，模型的準(zhǔn)確度最高。

2.9 異常值剔除 經(jīng)光譜Outliers優(yōu)化，以馬氏距離作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)異常值進(jìn)行剔除，以保證模型的準(zhǔn)確性，見(jiàn)圖3。異常值檢驗(yàn)表明樣品均符合要求。

2.10 定量模型的建立與驗(yàn)證 以篩選后的最優(yōu)預(yù)處理方法作為參數(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo)(表4)，建立定量模型，具體模型參數(shù)及各個(gè)變量實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性見(jiàn)圖4～6。

表4 定量模型參數(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo)

將預(yù)測(cè)集(n=16)樣品光譜輸入定量模型中，得出其預(yù)測(cè)值，通過(guò)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相對(duì)偏差，考察模型的準(zhǔn)確度，見(jiàn)表5與圖7。多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的平均相對(duì)偏差分別為1.60%、0.87%、0.14%，均小于2%，t檢驗(yàn)P值分別為0.92、0.84、0.86，均大于0.05，表明驗(yàn)證集預(yù)測(cè)值與檢驗(yàn)值無(wú)顯著性差異，模型準(zhǔn)確度良好。

表5 驗(yàn)證集含量預(yù)測(cè)與結(jié)果偏差

2.11 定量模型方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)，在“2.4”項(xiàng)下方法采集近紅外光譜圖6次，導(dǎo)入建立的近紅外定量模型中，預(yù)測(cè)多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)，取同一批樣品，分成6份，在“2.4”項(xiàng)下方法采集近紅外光譜圖，導(dǎo)入建立的近紅外定量模型中，預(yù)測(cè)多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)，取同一批樣品，分別于0、1、2、4、8、12 d，在“2.4”項(xiàng)下方法采集近紅外光譜圖，導(dǎo)入建立的近紅外定量模型中，預(yù)測(cè)多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型穩(wěn)定性良好。

3 討論

本研究測(cè)定黃精的含量，通過(guò)近紅外光譜法結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立黃精近紅外多指標(biāo)定量模型，建立模型的R值均大于0.9，相對(duì)偏差均小于2%，模型準(zhǔn)確度良好，實(shí)現(xiàn)了近紅外光譜技術(shù)在黃精飲片中的首次應(yīng)用以及多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量的快速測(cè)定，為其在炮制全過(guò)程質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。