陳 超， 黃 平， 林若冰， 范雪敏， 余 綺， 傅丹青*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005；3.浙江藥科職業(yè)大學(xué)，浙江 寧波 315153)

絞股藍(lán)總皂苷是對從絞股藍(lán)中提取出80余種皂苷的總稱，是絞股藍(lán)中活性較強(qiáng)的成分，也是發(fā)揮降血脂作用的主要活性成分。絞股藍(lán)又名五葉參、七葉膽、天堂草，為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)攀援植物，因其卷曲莖蔓纏絞攀緣而生，其葉似小藍(lán)葉，故名“絞股藍(lán)”。絞股藍(lán)在古籍中的記載最早可以追溯到《救荒本草》，該書不僅在本草救荒方面起到極大作用，還開創(chuàng)了我國野生植物研究與利用的歷史，由此絞股藍(lán)開始逐漸為人們熟知及應(yīng)用[1]。絞股藍(lán)中含有絞股藍(lán)總皂苷、絞股藍(lán)黃酮、絞股藍(lán)多糖等多種活性成分，其中絞股藍(lán)總皂苷含量最高，可溶于水、乙醇和氯仿中，具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化等藥理作用[2-5]。目前，對于絞股藍(lán)總皂苷降血脂方面的相關(guān)研究仍未深入探索，其作用機(jī)制尚未明確，因此本研究通過建立體外脂肪細(xì)胞模型，探討絞股藍(lán)總皂苷對促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞棕色化和抑制自噬活性的影響，以期為絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購自美國ATCC公司。

1.2 試劑與藥物 絞股藍(lán)總皂苷(貨號(hào)FY1362，純度98%)購自南通飛宇生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)C11995500BT)購自美國Gibco公司；地塞米松(貨號(hào)D4902)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(貨號(hào)I7018)、油紅O染液(貨號(hào)O0625)均購自美國Sigma公司；胰島素購自丹麥諾和諾德公司；CCK8試劑盒(貨號(hào)BS350B)購自合肥白鯊生物科技有限公司；鼠源Total OXPHOS Rodent抗體(貨號(hào)ab110414)、兔源UCP1抗體(貨號(hào)ab209483)、兔源PGC-1α抗體(貨號(hào)ab54481)均購自英國Abcam公司；兔源SQSTM1/P62抗體(貨號(hào)5114)、兔源Beclin-1抗體(貨號(hào)3495)、兔源LC3A/B抗體(貨號(hào)12741)、兔源α-Tubulin抗體(貨號(hào)2144)、兔抗HRP標(biāo)記二抗(貨號(hào)7074)、鼠抗HRP標(biāo)記二抗(貨號(hào)7076)均購自美國CST公司。

1.3 儀器 超低溫冰箱、微量離心機(jī)、生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、微量核酸蛋白分析儀、NanoDrop One酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；高速離心機(jī)、梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)；倒置顯微鏡[麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；蛋白掃膜儀(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照每孔3×104/mL的密度接種于6孔板中，待其生長至接觸抑制狀態(tài)(即達(dá)到100%融合)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h(第0天)，吸棄孔中液體，加入2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(含1 μg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h(第3天)，吸棄孔中液體，加入2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ(含1 μg/mL胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h(第5天)，吸棄孔中液體，加入2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于第8～12天，每隔2 d更換培養(yǎng)液，直至超過85%的細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞(大量脂滴形成)，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞 取“2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)的成熟脂肪細(xì)胞，吸棄孔中液體，PBS漂洗3次，每孔加入2 mL 10%多聚甲醛，室溫固定30 min，吸棄孔中液體，PBS漂洗3次，每孔加入2 mL經(jīng)稀釋的油紅O儲(chǔ)存液，避光染色1 h，棄油紅O儲(chǔ)存液，PBS漂洗3次，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 CCK8法篩選絞股藍(lán)總皂苷的干預(yù)劑量 3T3-L1前脂肪細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法培養(yǎng)，在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后，棄去原有的培養(yǎng)基，加入含有不同質(zhì)量濃度絞股藍(lán)總皂苷(0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、200 μg/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，干預(yù)48 h后，加入 CCK8溶液后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度，通過與對照組(0 μg/mL絞股藍(lán)總皂苷)比較，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)CCK8法篩選絞股藍(lán)總皂苷干預(yù)劑量結(jié)果，分別設(shè)置對照組(0 μg/mL)和絞股藍(lán)總皂苷低、中、高劑量組(0.1、1、10 μg/mL)。

2.5 Western blot法檢測棕色脂肪產(chǎn)熱相關(guān)蛋白、線粒體及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法誘導(dǎo)分化成熟后，按“2.4”項(xiàng)下分組進(jìn)行干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解提取總蛋白，BCA法定量后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min進(jìn)行變性，蛋白樣本經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗UCP1(1∶2 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Total OXPHOS Rodent(1∶250)、LC3(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、SQSTM1/P62(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日加入二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與α-Tubulin的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 RT-qPCR檢測棕色脂肪特異性基因、產(chǎn)熱基因及線粒體相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法誘導(dǎo)分化成熟后，按“2.4”項(xiàng)下分組進(jìn)行干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA的濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)40次，根據(jù)PCR擴(kuò)增所得各組的目的基因和內(nèi)參基因的CT值，以2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因Cidea、Dio2、Cox2、Cox8b的相對表達(dá)。引物序列見表1。

3 結(jié)果

3.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟的鑒定 3T3-L1前脂肪細(xì)胞未經(jīng)誘導(dǎo)分化時(shí)呈梭形或多邊形，而經(jīng)過誘導(dǎo)分化之后，可以觀察到細(xì)胞的體積逐漸增大，形狀逐漸變圓，細(xì)胞內(nèi)脂滴不斷形成，并呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。油紅O染色結(jié)果顯示，分化成熟的3T3-L1細(xì)胞內(nèi)脂滴能被特異性染成明亮的紅色，而未分化成熟的細(xì)胞內(nèi)非脂質(zhì)成分則不被染色，見圖1。

3.2 絞股藍(lán)總皂苷干預(yù)劑量的篩選 與對照組比較，絞股藍(lán)總皂苷質(zhì)量濃度大于10 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，故選擇對細(xì)胞活力無影響的最大質(zhì)量濃度1 μg/mL為中劑量，0.1、10 μg/mL為低、高劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

3.3 絞股藍(lán)總皂苷對3T3-L1前脂肪細(xì)胞棕色脂肪產(chǎn)熱相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，絞股藍(lán)總皂苷各劑量組UCP1、PGC-1α蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，見圖3。

3.4 絞股藍(lán)總皂苷對3T3-L1前脂肪細(xì)胞線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，絞股藍(lán)總皂苷各劑量組Complex Ⅰ、Ⅱ蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，Complex Ⅳ蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01),Complex Ⅲ蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；絞股藍(lán)總皂苷低、高劑量組Complex Ⅴ蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，見圖4。

3.5 絞股-藍(lán)總皂苷對3T3-L1前脂肪細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，絞股藍(lán)總皂苷各劑量組SQSTM1/P62蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；絞股藍(lán)總皂苷低劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，中、高劑量組則降低(P<0.01)；絞股藍(lán)總皂苷低、高劑量組Beclin-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖5。

3.6 絞股藍(lán)總皂苷對3T3-L1前脂肪細(xì)胞Cidea、Dio2、Cox2、Cox8bmRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，絞股藍(lán)總皂苷各劑量組Cidea、Cox2、Cox8bmRNA表達(dá)升高(P<0.01)，絞股藍(lán)總皂苷高劑量組Dio2 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，見圖6。

4 討論

目前認(rèn)為，肥胖癥的發(fā)生主要與機(jī)體攝入過多能量引起脂肪過度堆積相關(guān)，是一種能量代謝平衡紊亂的代謝性綜合征[6]。棕色脂肪組織減少以及白色脂肪組織堆積是肥胖癥的發(fā)病機(jī)制之一[7]。白色脂肪組織主要分布在皮下和內(nèi)臟周圍，將機(jī)體內(nèi)過剩的能量通過白色脂肪的形式進(jìn)行貯存[8]。棕色脂肪組織主要分布在頸部、鎖骨上區(qū)、椎旁等，消耗能量以產(chǎn)生熱量[9]。有研究表明，脂肪組織并非是靜止的狀態(tài)，而是處于一種動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化的過程[10-11]。白色脂肪組織在一定的刺激下向棕色脂肪組織發(fā)生轉(zhuǎn)變，白色脂肪細(xì)胞內(nèi)單泡脂滴體積減小、數(shù)量增加，UCP1和PGC-1α呈現(xiàn)高表達(dá)，從而使能量消耗增加，這一過程被稱為白色脂肪棕色化，并且以存在較多的線粒體為特征[12]。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化代謝活動(dòng)、制造并釋放能量的單元，并且它還是細(xì)胞內(nèi)最大的鐵代謝場所，正是由于富含線粒體，使得棕色脂肪呈現(xiàn)棕色樣改變[13]。線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈，亦稱線粒體呼吸鏈，其主要分布在線粒體的內(nèi)膜上，并由跨膜蛋白復(fù)合體(線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、位于Complex Ⅰ/Ⅱ與Ⅲ之間的泛醌以及位于Complex Ⅲ與Ⅳ之間的細(xì)胞色素共同構(gòu)成[14]。在線粒體氧化磷酸化的過程中，Complex Ⅰ、Ⅱ扮演著門控的角色，是電子進(jìn)入線粒體電子傳遞鏈的主要單元，還起到將電子傳遞給Complex Ⅲ、Ⅳ的作用；Complex Ⅲ作為泛素-細(xì)胞色素C氧化還原酶，是線粒體發(fā)生氧化磷酸化這一生物過程的必要元素；Complex Ⅳ作為線粒體電子傳遞鏈的終端電子受體，同時(shí)又是細(xì)胞色素C氧化酶，能夠?qū)?xì)胞色素C進(jìn)行催化氧化，將O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O；Complex Ⅴ協(xié)同上述4種復(fù)合物參與完成線粒體氧化磷酸化的最終環(huán)節(jié)，并產(chǎn)生ATP，被稱為ATP合成酶。當(dāng)線粒體數(shù)量增多時(shí)，可以觀察到Complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表達(dá)升高。

在肥胖癥中，白色脂肪組織的自噬被過度激活，機(jī)體從自身脂肪組織中回收能量，并利用該能量產(chǎn)生更多的脂肪，抑制自噬可以促進(jìn)白色脂肪棕色化，減少白色脂肪組織的堆積，從而延緩肥胖癥的進(jìn)展[15-17]，自噬活性受到抑制時(shí)往往伴隨著Beclin-1和LC3表達(dá)的降低和SQSTM1/P62表達(dá)的升高[18-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)總皂苷可以通過提高棕色脂肪產(chǎn)熱相關(guān)蛋白UCP1、PGC-1α，線粒體相關(guān)蛋白Complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ表達(dá)以及棕色脂肪特異性基因Cidea、棕色脂肪產(chǎn)熱基因Dio2、線粒體相關(guān)基因Cox2和Cox8bmRNA表達(dá)，從而促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞棕色化。絞股藍(lán)總皂苷還可通過降低自噬相關(guān)蛋白Complex Ⅳ、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)以及提高SQSTM1/P62蛋白表達(dá)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的自噬活性，且作用閾值可能為低質(zhì)量濃度，后續(xù)將進(jìn)一步調(diào)整劑量進(jìn)行研究。

綜上所述，絞股藍(lán)總皂苷可以促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞棕色化并抑制其自噬活性，可為其進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。