夏 玲， 周桂生， 嚴(yán) 輝， 伊艷玲， 李海洋， 吳勵萍， 謝 紅， 魏丹丹， 段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，功效清熱解毒、平肝明目、散風(fēng)清熱[1]，含有豐富的黃酮、酚酸、生物堿、萜類、揮發(fā)油、多糖等成分[2-5]，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗病原微生物、調(diào)節(jié)心血管功能等多種藥理活性[6-7]。文獻[8-9]報道了采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化菊花中揮發(fā)油、總黃酮提取工藝，以及抗氧化活性評價[10]，但尚無結(jié)合浸膏得率、化學(xué)成分、活性實驗綜合評價提取工藝的研究。因此，本實驗結(jié)合總黃酮含量[11-12]、浸膏得率、總抗菌活性評分來優(yōu)化菊花提取工藝，以期實現(xiàn)該植物高值化利用，提升資源利用效率，并為相關(guān)產(chǎn)品的進一步開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 植物 菊花于2020年10月采自江蘇省鹽城市射陽縣洋馬鎮(zhèn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC 25923)、大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC 8739)，均來自廣東省微生物研究所。

1.3 試劑與藥物 蘆丁對照品(南京良緯生物科技有限公司，批號lw18012501)。青霉素G鈉(羅恩試劑)；氯霉素(阿拉丁試劑上海有限公司)；瓊脂粉、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、胰蛋白胨、酵母粉(上海源葉生物科技有限公司)；氯化鈉(南京化學(xué)試劑有限公司)。無水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；水為蒸餾水(實驗室自制)。

1.4 儀器 Labcanco真空冷凍干燥機(北京照生行儀器設(shè)備有限公司)；SX-700立式高壓滅菌鍋(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；超凈工作臺(上海寶賽生物科技有限公司)；IS-rDV1生化培養(yǎng)箱(美國精騏有限公司)；EPED-E2-30TF實驗室級超純水器(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)；UV-2000紫外-可見光分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；電子天平[萬分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 浸膏得率測定 取1 mL藥液至離心管(質(zhì)量為A)中，濃縮得干浸膏(質(zhì)量為B)，計算得率，公式為得率=[(B-A)V/M]×100%[13]，其中V為樣品總體積，M為生藥量。

2.2 提取工藝

2.2.1 單因素試驗 以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素，總黃酮含量為評價指標(biāo)，因素水平見表1。

表1 單因素試驗因素水平

2.2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素，總黃酮含量、浸膏得率、總抗菌活性評分的綜合評分為評價指標(biāo)，建立17組試驗，采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，每組3份，取平均值。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品40 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，混勻，即得(質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL)，在4 ℃下保存。

2.3.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約3.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，按照一定料液比加入乙醇，稱定質(zhì)量，在80 ℃下回流提取2 h，放冷，乙醇補足減失的質(zhì)量，重復(fù)1次，合并提取液，13 000 r/min離心15 min，取上清液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL對照品溶液，置于10 mL離心管中，純水補足至2.0 mL，搖勻，加5%硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4%NaOH溶液(1 mol/L)5 mL，靜置15 min，以相應(yīng)試劑為空白對照，采用紫外分光光度計在510 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行回歸，得方程為A=2.862 2X-0.017 1(R2=0.997 9)。

2.4 抗菌活性測定

2.4.1 菌懸液制備 將凍存于-80 ℃冰箱中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌置于37 ℃水浴中解凍，表面消毒后置于超凈工作臺，輕輕吹打均勻后移取100 μL菌液至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。將活化菌株接種在LB固體培養(yǎng)基中，在37 ℃下活化培養(yǎng)18～24 h，并挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)12 h，取對數(shù)生長期者，采用滅菌空白培養(yǎng)基校正菌液，使其濃度約為1×106～1×107CFU/mL。

2.4.2 供試品溶液制備 取藥液適量，揮干乙醇后置于凍干機中凍干成粉末，精密稱取適量溶于無菌水中，即得(質(zhì)量濃度為60 mg/mL)。

2.4.3 最小抑菌濃度(MIC)測定 在96孔聚苯乙烯板中的第1排加入藥液、LB液體培養(yǎng)基各50 μL，吸打混勻，第2排加入藥液67 μL、LB液體培養(yǎng)基133 μL，于第3、4排中每孔加100 μL LB液體培養(yǎng)基，第2排每孔取100 μL加至第3排，再從第3排每孔取100 μL加至第4排，將藥液稀釋至15～2.5 mg/mL，以不加藥液為空白對照，大腸桿菌以氯霉素為陽性對照，金黃色葡萄球菌以青霉素G鈉為陽性對照。最后，每孔加入含菌株的混懸液100 μL(濃度約為1×106CFU/mL)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，加入0.01% TTC溶液再培養(yǎng)2 h，以不顯紅色的最低濃度為MIC，平行3次，每次3個復(fù)孔，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗 精密吸取1.0 mL對照品溶液，按“2.3.3”項下方法測定6次吸光度，測得其RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

3.1.2 重復(fù)性試驗 稱取藥材6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為1.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗 稱取同一份藥材，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、24、48 h按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為1.91%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.4 加樣回收率試驗 取總黃酮含量已知的藥材6份，精密加入蘆丁對照品適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，計算回收率。結(jié)果，總黃酮平均加樣回收率為101.3%，RSD為2.03%。

3.2 單因素試驗

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定料液比為1∶15，提取時間為1.5 h，提取次數(shù)為2次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%對總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，總黃酮含量呈先升后降的趨勢，在60%時最高，故選擇60%作為乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響

3.2.2 料液比 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為2 h，提取次數(shù)為2次，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著料液比增加，總黃酮含量呈先升后降的趨勢，在1∶20時最高，故選擇1∶20作為料液比。

圖2 料液比對總黃酮含量的影響

3.2.3 提取時間 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶20，提取次數(shù)為2次，考察提取時間0.5、1、1.5、2、

2.5 h對總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，提取1.5 h時總黃酮含量最高，故選擇1.5 h作為提取時間。

圖3 提取時間對總黃酮含量的影響

3.3 抗菌活性實驗 分別對不同提取工藝下藥液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC進行評分(MIC≤2.5 mg/mL，4分；2.5 mg/mL10 mg/mL，1分)，重復(fù)3次，取平均值，最后將兩者求和，得到總抗菌活性評分，結(jié)果見表2。

表2 抗菌活性實驗結(jié)果(分，n=3)

3.4 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理作進一步優(yōu)化，因素水平見表3。以綜合評分H為評價指標(biāo)[14]，計算公式為Hi=ΣWj×Hij*，其中Hi為第i號試驗的總綜合評分，Wj為權(quán)重(浸膏得率權(quán)重為0.3，總黃酮含量權(quán)重為0.4，抗菌活性權(quán)重為0.3)[15]，Hij為第i號試驗j項指標(biāo)消除量綱后的評分；Hij*=[(Hij-Hjmin)×100]/(Hjmax-Hjmin)，其中Hij為第i號試驗j項指標(biāo)測量值，Hjmax為第j項指標(biāo)中的最大值，Hjmin為第j項指標(biāo)中的最小值，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法因素水平

表4 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果(n=3)

表5 方差分析

響應(yīng)面分析[18]見圖4，可知BC響應(yīng)曲面較AB、AC更陡峭，即其交互作用更顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素響應(yīng)面圖

3.5 驗證試驗 通過Design-Expert8.0.6軟件得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶25，提取時間74.4 min，提取次數(shù)2次，綜合評分為72.657分，考慮到實際操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶25，提取時間75 min，提取次數(shù)2次，再進行3批驗證試驗，結(jié)果見表6。由此可知，浸膏得率、總黃酮含量較高，抗菌活性較強，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表6 驗證試驗結(jié)果(n=3)

4 討論與結(jié)論

目前，提取工藝優(yōu)化的主要方法有正交設(shè)計、均勻設(shè)計、Box-Behnken響應(yīng)面法等，其中Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合了數(shù)學(xué)建模和試驗設(shè)計，不包含所有因素同時處于其最高或最低水平的組合，可避免一些極端值，如今廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝優(yōu)化中[19-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，菊花對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用，并且不同提取條件下其抗菌活性存在一定差距；最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶25，提取時間75 min，浸膏得率、總黃酮含量較高，抗菌活性強，表明Box-Behnken響應(yīng)面法穩(wěn)定可行，彌補了該植物優(yōu)化抗菌工藝的空白，可為后續(xù)基于抗菌功效的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。