林凱莉， 張世卿

(1.廣州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院, 廣東 廣州 511436；2.香港浸會大學生物系，香港 九龍?zhí)?999077)

阿爾茲海默癥是最常見的神經退行性疾病，主要表現(xiàn)為認知及記憶損傷，尚缺乏有效的治療藥物。大腦海馬區(qū)是調控認知和記憶功能的主要腦區(qū)，海馬神經發(fā)生是指海馬區(qū)神經干細胞(neural stem cells, NSCs)分化產生新生神經元的過程，最新研究發(fā)現(xiàn)成人也存在海馬神經發(fā)生現(xiàn)象，但阿爾茲海默癥患者的海馬NSCs分化成為神經元的能力下降，導致神經發(fā)生水平被抑制[1]。因此，促進海馬神經發(fā)生修復受損神經元是治療阿爾茲海默癥的有效策略[2]。中藥姜黃是治療阿爾茲海默癥的常用藥物，臨床療效顯著[3]。去甲氧基姜黃素是姜黃的主要活性成分之一，具有一定的神經保護作用[4]，但其抗阿爾茲海默癥作用還未明確。此外，姜黃素被證實可以通過促進NSCs分化產生新生神經元有效治療小鼠阿爾茲海默癥[5]，去甲氧基姜黃素作為姜黃素的天然衍生物之一，而關于其對NSCs的影響以及是否通過促進海馬神經發(fā)生有效治療阿爾茲海默癥的研究機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討去甲氧基姜黃素對NSCs的影響以及其通過促進海馬神經發(fā)生改善阿爾茲海默癥的機制，以期為去甲氧基姜黃素作為抗阿爾茲海默癥潛在治療藥物奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 動物 新生1～2 d的SD大鼠購自香港中文大學；雄性APP/PS1雙轉基因小鼠及野生型(WT)SPF級小鼠購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2018-0034，在光照/黑暗12 h/12 h周期中自由活動飲食。

1.2 試劑與藥物 去甲氧基姜黃素(批號24939-17-1，純度99.43%)購自成都曼思特生物科技有限公司；DMSO(批號D4540)、β-actin抗體(批號A5316)購自美國Sigma公司；聚乙二醇(批號P103728)、吐溫-80(批號T104866)購自上海阿拉丁生化科技有限公司；表皮生長因子(EGF，批號AF-100-15-100UG)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，批號AF-100-18B-100UG)、B27添加劑(批號17504-044)、青霉素-鏈霉素-新霉素溶液(批號15640-055)、神經基礎培養(yǎng)基(批號21103-049)購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑(批號PH536)購自日本同仁公司；DAPI(批號10236276001)購自瑞士Roche公司；p-GSK-3β(Ser9) 抗體(批號5558S)、GSK-3β抗體(批號9315S)、β-catenin抗體(批號8814S)購自美國Cell Signaling Technology公司；巢蛋白(Nestin，批號MAB5326)、MAP2抗體(批號AB2290)、Sox2(批號AB5603)抗體購自美國EMD Millipore公司；BCA蛋白測定試劑盒(批號23227)購自美國Thermo公司；化學發(fā)光試劑盒(批號 TJA07)購自韓國AbFrontier公司；羊抗兔二抗(批號65-6120)、羊抗鼠二抗(批號62-6520)購自美國Invitrogen公司。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Shellab公司)；LABGARD生物安全柜(美國NuAire公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；電泳儀、ChemiDoc Touch化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；水迷宮實驗裝置、Y迷宮實驗裝置(廣州格物智源生物科技有限公司)；Pannoramic Desk Scanner數(shù)字切片掃描儀及CaseViewer軟件(匈牙利3DHISTECH公司)。

2 方法

2.1 原代NSCs培養(yǎng) 參考文獻[6]報道培養(yǎng)原代NSCs。新生1～2 d的SD大鼠快速取腦，分離室下區(qū)組織并浸泡在冰Hank’s平衡鹽溶液中，切塊后用胰蛋白酶在37 ℃下消化15 min，將組織懸液用40 μm細胞濾網過濾，濾液1 000 r/min離心5 min后棄上清液，將細胞重懸于含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、1%青霉素-鏈霉素-新霉素溶液和2% B27的神經基礎培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換一半培養(yǎng)基，當神經球直徑達到150～200 μm時進行傳代。

2.2 NSCs增殖檢測 NSCs接種于96孔板中，加入去甲氧基姜黃素(1.25、2.5、5 μmol/L)培養(yǎng)3 d后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值。

2.3 NSCs分化檢測 將NSCs接種于鋪有蓋玻片的6孔板上，使用NSCs分化培養(yǎng)基(含1%青霉素-鏈霉素-新霉素溶液和2% B27的神經基礎培養(yǎng)基)聯(lián)合去甲氧基姜黃素(1.25、2.5、5 μmol/L)誘導NSCs分化7 d后，通過Western blot實驗檢測NSCs分化標志物Nestin(NSCs標記物)和MAP2(神經元標記物)蛋白表達，分析NSCs的分化。

2.4 分組及給藥 5月齡APP/PS1雙轉基因小鼠及WT小鼠隨機分為對照組(WT小鼠)、模型組(APP/PS1小鼠)及去甲氧基姜黃素低、高劑量組(APP/PS1小鼠，2.5、5.0 mg/kg)，每組6只。去甲氧基姜黃素以混合溶劑(10% DMSO、40% 聚乙二醇300、5%吐溫-80、45%生理鹽水)溶解后，給藥組小鼠進行腹腔注射，模型組、對照組小鼠腹腔注射等體積溶劑，每天1次，共28 d。行為學實驗結束后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，手術刀切開前胸，暴露心臟，在心尖處插入輸液針頭，剪開右心房，用生理鹽水灌注，待肝臟變白后，在冰上迅速斷頭并完整取出腦組織，每組取3個用于組織病理學檢查，浸泡于固定液中48 h后石蠟包埋；再取3個，在-80 ℃下保存，用于Western blot檢測。

2.5 行為學實驗

2.5.1 水迷宮實驗 參考文獻[7]報道，水迷宮水池(直徑120 cm)中充滿水后被平均分為4個象限，隱蔽平臺(直徑10 cm)位于1個象限的中心水面下1 cm處。水迷宮實驗包括訓練和探索實驗2個階段，訓練階段每只小鼠隨機釋放在4個象限，若未能在60 s內找到平臺，則將其引導找到平臺并允許其停留10 s，每只訓練5 d(每天連續(xù)4次，間隔10 min)。探索實驗時撤除平臺，允許每只小鼠探索60 s，記錄在目標象限所用時間、運動距離、通過平臺位置次數(shù)。

2.5.2 Y迷宮實驗 參考文獻[7]報道，Y迷宮由3個臂(長30 cm、寬7 cm、高15 cm)組成，夾角120°。在訓練階段，新異臂被阻擋，允許小鼠自由探索另2只臂(起始臂和其他臂)5 min，小鼠被送回籠子1 h后打開3個臂，再放入起始臂并使其自由探索3 min，記錄進入新異臂的距離、時間和次數(shù)。

2.6 Western blot檢測Nestin、MAP2、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin蛋白表達 使用蛋白提取試劑從各組細胞或海馬組織勻漿中提取蛋白，BCA法進行蛋白定量檢測。取30 μg蛋白，在10% SDS-PAGE膠進行電泳分離，并轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Nestin、MAP2、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β和β-catenin(1∶1 000)一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗膜后加入特異性二抗常溫孵育1 h，以β-actin為內參蛋白。采用化學發(fā)光試劑進行顯色，通過ChemiDoc Touch化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對表達量。

2.7 Nissl染色 石蠟包埋的小鼠腦組織進行冠狀切片(5 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，常規(guī)甲苯胺藍Nissl染色液染色，中性樹脂封片。封片后，采用數(shù)字切片掃描儀、CaseViewer軟件對海馬區(qū)進行掃描分析，計算海馬CA1、CA3、DG區(qū)域中Nissl+細胞數(shù)。

2.8 組織免疫熒光染色 腦組織石蠟切片脫蠟脫水后，加入Sox2一抗(NSCs標記物)，在4 ℃下孵育過夜，再用帶熒光素標記的二抗在室溫下孵育3 h，DAPI(1 μg/mL)復染細胞核。封片后，采用數(shù)字切片掃描儀、CaseViewer軟件對海馬區(qū)進行掃描分析，計算每個隨機視野中Sox2+細胞數(shù)。

3 結果

3.1 去甲氧基姜黃素促進NSCs增殖 如圖1所示，去甲氧基姜黃素可劑量依賴性地增加NSCs存活率(P<0.05，P<0.01)，并且濃度在2.5 μmol/L時最高，表明該成分可促進NSCs在體外的增殖。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 去甲氧基姜黃素促進NSCs分化 如圖2所示，去甲氧基姜黃素可劑量依賴性地降低Nestin蛋白表達(P<0.01)，升高MAP2蛋白表達(P<0.01)，表明該成分可促進NSCs往神經元方向的分化。

注：A為NSCs分化蛋白條帶，B為蛋白定量分析。與對照組比較，**P<0.01。

3.3 去甲氧基姜黃素激活NSCs中GSK-3β/β-catenin通路 GSK-3β通過Ser9處的磷酸化使GSK-3β失活并激活GSK-3β/β-catenin通路，是促進NSCs增殖和分化的主要通路之一[6]。如圖3所示，去甲氧基姜黃素能劑量依賴性地提高NSCs中p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin/β-actin蛋白表達比值(P<0.05，P<0.01)，激活GSK-3β/β-catenin通路，表明該成分介導的NSCs增殖和分化可能通過抑制GSK-3β活性來激活GSK-3β/β-catenin通路。

3.4 去甲氧基姜黃素改善APP/PS1小鼠的認知損傷狀態(tài) 水迷宮實驗平臺設置如圖4A所示。在訓練階段，與對照組比較，模型組小鼠尋找平臺所需時間增長(P<0.01)；與模型組比較，去甲氧基姜黃素組小鼠尋找平臺所需時間縮短(P<0.05，P<0.01)(圖4B)。在移除平臺后，與模型組比較，去甲氧基姜黃素組小鼠在目標象限停留時間增長(P<0.05，P<0.01)(圖4C)，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)(圖4D)。

Y迷宮實驗3臂設置如圖4E所示。與模型組比較，去甲氧基姜黃素組小鼠在新異臂中停留時間(圖4F)及運動距離(圖4G)都均增加(P<0.05)，而進入新異臂的次數(shù)有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖4H)，表明該成分可改善APP/PS1小鼠的認知損傷狀態(tài)。

3.5 去甲氧基姜黃素促進APP/PS1小鼠的海馬神經發(fā)生 如圖5～6所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬各區(qū)域Nissl+細胞比例均減少(P<0.05，P<0.01)，海馬DG區(qū)中Sox2+細胞數(shù)減少(P<0.01)；與模型組比較，去甲氧基姜黃素組小鼠海馬區(qū)域中Nissl+細胞的比例增加(P<0.05)，海馬DG區(qū)中Sox2+細胞數(shù)增加(P<0.01)，表明該成分可增強APP/PS1小鼠的海馬神經發(fā)生水平。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

注：A為海馬區(qū)Nissl染色(×400)，B為海馬區(qū)Nissl+細胞相對數(shù)量。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

注：A為海馬區(qū)免疫熒光染色(×400)，綠色為Sox2陽性，藍色為細胞核，B為海馬區(qū)Sox2+細胞數(shù)量。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

注：A為GSK-3β/β-catenin通路蛋白條帶，B為蛋白條帶定量分析。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.6 去甲氧基姜黃素激活APP/PS1小鼠海馬的GSK-3β/β-catenin通路 如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬中GSK-3β/β-catenin通路的活性受到抑制(P<0.01)；與模型組比較，去甲氧基姜黃素組可上調海馬中p-GSK-3β/GSK-3β和β-catenin/β-actin蛋白表達比值(P<0.05，P<0.01)，即GSK-3β/β-catenin通路被激活，表明該成分促進APP/PS1小鼠海馬神經發(fā)生及改善認知損傷的作用可能依賴于GSK-3β/β-catenin通路的激活。

4 討論

隨著人口老齡化的快速發(fā)展，神經退行性疾病的發(fā)病率急劇上升[8]。2019年全球阿爾茲海默癥患者已超過5 000萬，而中國阿爾茲海默癥患者接近1 000萬，預計到2030年中國阿爾茲海默癥患者將超過2 300萬[9]。盡管目前藥物研發(fā)取得巨大進展，但仍缺乏有效的治療藥物。阿爾茲海默癥的致病原因復雜，但目前已發(fā)現(xiàn)的多種與阿爾茲海默癥相關致病因素均與海馬神經發(fā)生被抑制有關，包括淀粉樣蛋白-β(Aβ)水平失調[10]、Tau蛋白異常酸化[11]、神經炎癥[12]以及年齡[13]等。因此，促進海馬下區(qū)NSCs分化產生新的神經元，增強成年海馬神經生成可能是一種治療阿爾茲海默癥的策略[2]。然而，NSCs在正常情況下分化能力有限，必須在刺激物的誘導下才能促進其分化產生神經元[14]。最近的研究進展及本實驗室以往的研究工作證明，利用外源基因或藥物干預促進海馬神經發(fā)生可以改善阿爾茲海默癥小鼠的認知障礙[7,15]。

去甲氧基姜黃素作為姜黃素的天然衍生物，是中藥姜黃的主要活性成分之一，但其抗阿爾茲海默癥的作用效果及機制尚未清楚。有報道指出姜黃素可以通過抑制GSK-3β活性保護神經元抗Aβ引起的神經元毒性作用[16]。GSK-3β/β-catenin信號通路被認為是調控NSCs增殖和分化的關鍵通路，并在調控阿爾茲海默癥患者海馬神經發(fā)生中起著至關重要的作用[17]。課題組前期研究表明，利用中藥活性小分子抑制GSK-3β活性激活GSK-3β/β-catenin通路可促進NSCs增殖，促使其分化為神經元[6]，并可以改善海馬神經發(fā)生進而治療阿爾茲海默癥[7]，提示GSK-3β/β-catenin通路是藥物的理想靶點。本研究也首次證實去甲氧基姜黃素可抑制GSK-3β活性激活GSK-3β/β-catenin通路，促進海馬神經發(fā)生，發(fā)揮抗阿爾茲海默癥的作用。此外，有研究利用分子對接技術發(fā)現(xiàn)去甲氧基姜黃素可以與GSK-3β蛋白緊密結合，提示去甲氧基姜黃素可能通過直接作用于GSK-3β蛋白抑制其活性[18]，但去甲氧基姜黃素的直接作用靶點是否為GSK-3β還有待進一步研究確定。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)去甲氧基姜黃素可以促進神經干細胞在體外的增殖和分化產生神經元，并通過增強海馬神經發(fā)生水平有效改善轉基因阿爾茲海默癥小鼠的認知障礙，該作用可能與其激活GSK-3β/β-catenin通路相關。利用中藥活性成分促進海馬神經發(fā)生可能是治療阿爾茲海默癥和其他神經退行性疾病的有效途徑。