王 萍， 王宇鶴， 許 剛， 張瑞瑞， 廖予菲， 張夢娜， 賴普輝*

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安 712046；3.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)院，陜西 咸陽 712082；4.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

大葉秦艽為陜西、甘肅道地藥材，也是商品秦艽的主要來源，其味辛、苦，性平，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱功效[1]，含有環(huán)烯醚萜苷、黃酮、木脂素、多糖等成分[2]，其中環(huán)烯醚萜苷是龍膽屬植物特征化合物，也是秦艽活性成分之一，具有抗炎[3-5]、抗癌[6]、保肝[7-8]等作用。

目前，關(guān)于秦艽活性成分提取及抗氧化活性的文獻(xiàn)以總黃酮[9-10]、多酚[11]、熊果酸[12]為主，鮮有涉及環(huán)烯醚萜苷。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大葉秦艽回流提取、超聲提取、超聲-回流提取工藝，并考察其抗氧化活性，以期為后續(xù)該藥材品質(zhì)研究、復(fù)方制劑開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ME204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；FW177型中草藥粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司)；

龍膽苦苷對照品(DST200302-070，純度≥96%，德思特生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苦基肼(純度≥96%，美國Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

大葉秦艽采自陜西省寶雞市隴縣，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的根。

2 方法

2.1 藥材預(yù)處理 大葉秦艽飲片粉碎后過40目篩，粉末，置于干燥器中保存。

2.2 總環(huán)烯醚萜苷含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的大葉秦艽粉末2 g，分別進(jìn)行回流提取、超聲提取、超聲-回流提取，濾過，收集濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的龍膽苦苷對照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)。

2.2.3 線性關(guān)系考察 參考文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道并作適當(dāng)修改。精密吸取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，以甲醇為空白溶液，在272 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=24.338X-0.001 2(r=0.999 6)，在0.005～0.03 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.2 mg/mL對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度6次，測得其RSD為1.74%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取大葉秦艽粉末2 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD為1.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備同一份供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD為1.44%，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取9份1.473 3 mg/mL提取液，每份0.25 mL，按50%、100%、150%水平加入0.2 mg/mL對照品溶液，甲醇定容至50 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率分別為97.88%、98.83%、96.92%，RSD分別為1.51%、1.84%、1.41%。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 回流提取工藝

2.3.1.1 單因素試驗(yàn) 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、回流時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、提取次數(shù)(1、2、3、4次)對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響。

2.3.1.2 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取次數(shù)、回流時(shí)間為影響因素，總環(huán)烯醚萜苷含量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2 超聲提取工藝

2.3.2.1 單因素試驗(yàn) 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超聲時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(160、180、200、220、240 W)對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響。

2.3.2.2 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、超聲功率為影響因素，總環(huán)烯醚萜苷含量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.3 超聲-回流提取工藝

2.3.3.1 單因素試驗(yàn) 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超聲時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、回流時(shí)間(45、60、75、90、105 min)對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響。

2.3.3.2 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、回流時(shí)間為影響因素，總環(huán)烯醚萜苷含量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 總環(huán)烯醚萜苷抗氧化活性研究

2.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測定3次，通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，Microsoft Excel 2007、Origin 8.0.6、SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 回流提取工藝優(yōu)化

3.1.1 單因素試驗(yàn) 見圖1，最終設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～85%，液料比為16∶1～24∶1，回流時(shí)間為60～120 min，提取次數(shù)為1～3次，此時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量有最大值。

圖1 回流提取工藝中各因素對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響

3.1.2 響應(yīng)面法 因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 回流提取工藝因素水平

表2 回流提取工藝設(shè)計(jì)與結(jié)果

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得方程為Y=61.77+0.27A+1.48B+3.00C+5.90D-2.82AB-0.89AC-0.038AD-0.14BC-2.96BD-1.37CD-4.06A2-3.83B2-4.42C2-7.56D2，方差分析見表3。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數(shù)為4.44%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流時(shí)間、提取次數(shù)對總環(huán)烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，液料比有顯著影響(P<0.05)，而乙醇體積分?jǐn)?shù)無顯著影響(P>0.05)。

表3 回流提取工藝方差分析

響應(yīng)面分析見圖2，可知最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)74.80%，液料比20.24∶1，提取次數(shù)2.35次，回流時(shí)間98.58 min，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比20∶1，提取次數(shù)2次，回流時(shí)間100 min，總環(huán)烯醚萜苷含量為63.29 mg/g。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總環(huán)烯醚萜苷平均含量為62.75 mg/g，與預(yù)測值63.29 mg/g接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖2 回流提取工藝中各因素響應(yīng)面圖

3.2 超聲提取工藝優(yōu)化

3.2.1 單因素試驗(yàn) 見圖3，最終設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～85%，液料比為16∶1～24∶1，超聲時(shí)間為30～50 min，超聲功率為180～220 W，此時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量有最大值。

圖3 超聲提取工藝中各因素對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響

3.2.2 響應(yīng)面法 因素水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 超聲提取工藝因素水平

表5 超聲提取工藝設(shè)計(jì)與結(jié)果

對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得方程為Y=69.60+1.81A+1.55B+1.83C+0.53D-1.94AB+0.72AC+1.06AD-0.79BC-1.51BD+3.24CD-3.88A2-2.53B2-5.65C2-3.15D2，方差分析見表6。由此可知，模型P<0.001，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數(shù)為3.36%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；超聲時(shí)間對總環(huán)烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比有顯著影響(P<0.05)，而超聲功率無顯著影響(P>0.05)。

表6 超聲提取工藝方差分析

響應(yīng)面分析見圖4，可知最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)77.60%，液料比20.41∶1，超聲時(shí)間42.35 min，超聲功率204.51 W，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，液料比20∶1，超聲時(shí)間42 min，超聲功率204 W，總環(huán)烯醚萜苷含量為70.19 mg/g。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總環(huán)烯醚萜苷平均含量為70.25 mg/g，與預(yù)測值70.19 mg/g接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖4 超聲提取工藝中各因素響應(yīng)面圖

3.3 超聲-回流提取工藝優(yōu)化

3.3.1 單因素試驗(yàn) 見圖5，最終設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～85%，液料比為12∶1～20∶1，超聲時(shí)間為20～40 min，回流時(shí)間為60～90 min，此時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量有最大值。

圖5 超聲-回流提取工藝中各因素對總環(huán)烯醚萜苷含量的影響

3.3.2 響應(yīng)面法 因素水平見表7，結(jié)果見表8。

表7 超聲-回流提取工藝因素水平

表8 超聲-回流提取工藝試驗(yàn)與結(jié)果

對表8數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得方程為Y=77.16-0.15A+0.93B-1.22C-2.79D+2.28AB+0.077AC-0.88AD+1.98BC+0.077BD+1.45CD-1.47A2-3.05B2-6.15C2-9.13D2，方差分析見表9。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數(shù)為2.21%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流時(shí)間對總環(huán)烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，液料比、超聲時(shí)間顯著影響(P<0.05)，而乙醇體積分?jǐn)?shù)無顯著影響(P>0.05)。

表9 超聲-回流提取工藝方差分析

響應(yīng)面分析見圖6，可知最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)76.46%，液料比16.72∶1，超聲時(shí)間29.10 min，回流時(shí)間72.48 min，總環(huán)烯醚萜苷含量為77.55 mg/g，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)76%，液料比17∶1，超聲時(shí)間29 min，回流時(shí)間72 min。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總環(huán)烯醚萜苷平均含量為76.49 mg/g，與預(yù)測值77.55 mg/g接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖6 超聲-回流提取工藝中各因素響應(yīng)面圖

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取大葉秦艽粉末適量，分別按3種優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表10，可知超聲-回流提取工藝所得總環(huán)烯醚萜苷含量最高。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3.5 抗氧化活性研究 圖7顯示，3種提取工藝所得提取物清除DPPH、OH-自由基能力均與其質(zhì)量濃度成正比，其中對前者清除率的IC50分別為2.251、2.245、1.752 mg/mL，對后者清除率的IC50分別為2.871、2.701、2.234 mg/mL，可知超聲-回流提取工藝所得提取物的抗氧化活性最強(qiáng)。

圖7 提取物對各自由基的清除率

4 討論

環(huán)烯醚萜類成分是秦艽中含量最高的成分之一，也是其標(biāo)志化合物。預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了秦艽粉末提取溶劑，發(fā)現(xiàn)水提液中總環(huán)烯醚萜苷含量明顯低于醇提液中，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。

響應(yīng)面法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，并可連續(xù)地對試驗(yàn)因素的各個(gè)水平分析，從而避免了正交試驗(yàn)精密度不高、預(yù)測性不好的缺陷，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化大葉秦艽總環(huán)烯醚萜苷3種提取工藝，發(fā)現(xiàn)采用超聲-回流提取法時(shí)該成分含量明顯高于回流提取、超聲提取，而且該方法操作簡單，合理可行。

抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大葉秦艽總環(huán)烯醚萜苷質(zhì)量濃度為1～4 mg/mL時(shí)，其還原能力逐漸增強(qiáng)，與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道一致；為4 mg/mL時(shí)，超聲-回流提取的總環(huán)烯醚萜苷對DPPH、OH-自由基的清除率分別達(dá)(79.75±0.78)%、(75.16±0.64)%，遠(yuǎn)高于其他2種提取方法。今后，將重點(diǎn)考察大葉秦艽總環(huán)烯醚萜苷提取物質(zhì)量濃度與其抗氧化活性的相關(guān)性。