劉書豪， 王有憲， 邵仲柏， 蔣凱俊， 曹聯(lián)攻， 李 冰， 沈金陽(yáng)*，劉瑋煒*

(1.江蘇海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；4.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

海螵蛸是頭足綱烏賊科動(dòng)物無(wú)針烏賊或金烏賊的干燥內(nèi)殼[1]，分布于浙江、福建、山東等沿海地區(qū)。碳酸鈣、殼角質(zhì)與粘液質(zhì)占其成分含量的90%左右，還含有少量氯化鈉、磷酸鈣、鎂鹽等[2-3]。海螵蛸成分構(gòu)成中成分眾多[4]，具有極大的研究開發(fā)價(jià)值。當(dāng)前，對(duì)海螵蛸的研究多集中于治療胃潰瘍和成骨作用[5-7]，但對(duì)凝血止血機(jī)制的研究報(bào)道較少。鄭杰[8]等用黃芪和烏賊骨各30 g，再配伍其他止血藥治療由腎氣虛導(dǎo)致的術(shù)后出血不止，在服藥4劑后出血即止，可見海螵蛸可協(xié)同他藥發(fā)揮止血作用；盛福韶[9]用大黃炭海螵蛸粉，取適量涂于凡士林油紗條上，填塞出血鼻腔，連用7 d，有效率達(dá)94.4%。海螵蛸作為一味海洋中藥，其良好的凝血效果已被證實(shí)，但是其具體止血機(jī)制仍不清楚，其止血活性物質(zhì)也不明確，并且關(guān)于其止血作用機(jī)制和體外止血研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)海螵蛸提取物進(jìn)行體外促凝血檢測(cè)，探索其活性成分和止血機(jī)制。

1 材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)；TDL-40B電動(dòng)離心機(jī)(杭州南開日新生物技術(shù)有限公司)；AS-LGJ-10FG冷凍干燥機(jī)(鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司)；ACLTOPT00LAS全自動(dòng)血凝分析儀(西班牙巴塞羅那沃芬公司)。云南白藥(云南白藥集團(tuán)股份有限公司)。新鮮海螵蛸購(gòu)于連云港新浦區(qū)蒼梧生活廣場(chǎng)，經(jīng)江蘇海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉瑋煒教授鑒定為金烏賊SepiaesculentaHoyle內(nèi)殼，粉碎研磨制得。昆明種小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)康達(dá)醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2016-0002，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批號(hào)Jou-2020-Y-01-A。

2 方法

2.1 提取物制備

2.1.1 水提物 藥材研磨后過(guò)40目篩，稱取10 g，加去離子水100 mL，室溫浸泡6 h，在80 ℃下攪拌熱回流2 h[10]，濾過(guò)，重復(fù)提取1次，合并2次水提液，濾渣超聲提取40 min，合并濾液，25 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清，置于60 ℃烘箱中烘干濃縮后，旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，冷凍干燥，即得。

2.1.2 醇提物 取藥材粉末10 g，加100 mL 95%乙醇浸泡24 h，50 ℃加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾渣提取1次，超聲提取40 min，合并3次濾液，離心后取上清，蒸干，即得。

2.1.3 石油醚提取物 取藥材粉末10 g，加100 mL石油醚，室溫浸泡[11]一段時(shí)間后攪拌2 h，濾過(guò)，濾渣用石油醚同法提取1次，超聲提取40 min，合并3次濾液，離心后取上清，蒸干，即得。

2.2 活性成分分析 向盛有供試液的試管中或?yàn)V紙片上加入相關(guān)的化學(xué)試劑，根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象(顏色、沉淀等)來(lái)判斷某種活性成分在海螵蛸提取物中是否存在[12]。

2.3 凝血時(shí)間檢測(cè) 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制備枸櫞酸鈉抗凝血液，玻璃試管中加入藥液0.2 mL(37 ℃水浴預(yù)溫)，再加入氯化鈣溶液0.2 mL，搖勻后于各管內(nèi)同時(shí)加入小鼠抗凝血液0.5 mL，以云南白藥為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照，置于37 ℃水浴箱中振蕩搖晃后立即計(jì)時(shí)，每5 s輕輕傾斜試管1次，觀察有無(wú)凝血，到傾斜試管血塊凝固于管底而不流動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為凝血時(shí)間[13]，重復(fù)3次，取平均值。

2.4 凝血四項(xiàng)檢測(cè) 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制備枸櫞酸鈉抗凝血液(1份抗凝液+9份全血)，輕輕顛倒混勻，3 000 r/m離心15 min，收集上清液。取待測(cè)血漿0.1 mL，分為醇提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，水提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，石油醚提取物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，云南白藥(2.0 mg/mL)組，加入0.05 mL樣品，另設(shè)陰性對(duì)照組，加入0.05 mL生理鹽水，混勻，置于全自動(dòng)血凝分析儀上，檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APPT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)水平，重復(fù)6次，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 成分分析 由表1可知，海螵蛸提取物可能含有甾體三萜類、揮發(fā)油和油脂、皂苷、有機(jī)酸、內(nèi)酯、香豆素、糖類、氨基酸，未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)、蒽醌類、酚類、鞣質(zhì)等成分。

表1 提取物成分分析結(jié)果

3.2 提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 由表2可知，與空白組比較，水提物組凝血時(shí)間縮短(P<0.05)，接近陽(yáng)性對(duì)照組。

表2 提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響

3.3 提取物對(duì)小鼠凝血四項(xiàng)的影響 由表3可知，與空白組比較，水提物各劑量組小鼠PT、APPT縮短(P<0.05)，并呈劑量依賴性，但各提取物組TT、FIB水平均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表3 提取物對(duì)小鼠凝血四項(xiàng)的影響

4 討論

體外止血實(shí)驗(yàn)表明，海螵蛸提取物中水提物體外促凝效果良好，其活性成分中有良好的體外促凝物質(zhì)。海螵蛸主要促凝血成分為Ca離子、甲殼素、殼聚糖和提取物多糖[1]，其中甲殼素不溶于水，殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，海螵蛸中Ca離子存在形式為其主要成分CaCO3，并且難溶于水，推測(cè)活性成分可能為提取物多糖。凝血過(guò)程是一系列的酶促反應(yīng)，包括內(nèi)源性、外源性、共同凝血3個(gè)途徑，使血漿纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，血液由溶膠狀態(tài)變?yōu)槟z狀態(tài)[14]。凝血四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果表明，海螵蛸水提物能縮短小鼠PT、APTT，高劑量下更明顯，但TT、FIB基本無(wú)變化，其促凝血作用可能與外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑中影響凝血因子有關(guān)，同時(shí)其質(zhì)量濃度提高時(shí)可積極影響內(nèi)源性凝血中促進(jìn)凝血活酶形成過(guò)程中凝血因子、激肽釋放酶原的過(guò)程。