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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理與分子對接研究4味藥食兩用中藥治療2型糖尿病的機(jī)制

        2022-12-04 09:19:52呂宏陽
        中成藥 2022年10期
        關(guān)鍵詞:胰島素中藥數(shù)據(jù)庫

        褚 煜, 陳 海, 呂宏陽, 陳 艷, 王 建*

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,四川 成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611137;3.西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611137;4.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 611137)

        糖尿病是以胰島β細(xì)胞受損以及胰島素抵抗為主要病理特征的慢性代謝性疾病,主要分為1型糖尿病、2型糖尿病以及特殊類型糖尿病,臨床上以2型糖尿病患者居多[1]。2型糖尿病患者需要長期甚至終身用藥治療,但長期口服降糖藥物對肝腎損害較大,且隨著用藥時(shí)間的延長會出現(xiàn)藥物繼發(fā)性失效等問題[2]。

        藥食兩用中藥具有“多成分”“多靶點(diǎn)”“多通路”等特點(diǎn)與優(yōu)勢,且毒副作用小、不良反應(yīng)少,適合預(yù)防與治療2型糖尿病[3]。課題組前期基于輔助降血糖保健產(chǎn)品藥食兩用中藥原料統(tǒng)計(jì)[4]以及2020年版《中國藥典》中降糖處方的數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果,優(yōu)選出4味防治2型糖尿病的藥食兩用中藥,分別為黃芪、山藥、葛根、人參,但其防治2型糖尿病的機(jī)制不明,故本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的分析優(yōu)勢聯(lián)合分子對接結(jié)果,對其治療2型糖尿病的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

        1 材料

        藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫(https://www.drugfuture.com/standard/);藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php);人類基因數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/);比較毒物基因數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/);DAVID(https://david.ncifcrf.gov/);Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step);化學(xué)數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/)。Spass Modeler、Cytoscape3.6.1、Autodock Vina、Pymol等軟件。

        2 方法

        2.1 數(shù)據(jù)挖掘 以“消渴”“消渴病”“降糖”“糖尿病”“2型糖尿病”為檢索詞,檢索2020年版《中國藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫,獲取降糖處方數(shù)據(jù)。Spass Modeler進(jìn)行頻次、鏈接強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析,導(dǎo)入Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖,再結(jié)合糖尿病保健食品中排序前10的藥食兩用中藥[4],取交集后優(yōu)選出4味。

        2.2 藥物及疾病靶點(diǎn)篩選 從藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)中檢索獲取黃芪、山藥、葛根、人參主要成分及作用靶點(diǎn),檢索條件為生物利用度(OB)>30%,類藥性(DL)>0.18,并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Uniprot)中對成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換。人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)與比較毒物基因數(shù)據(jù)庫(CTD)中檢索與2型糖尿病相關(guān)的所有疾病靶點(diǎn),中位數(shù)篩選保留相關(guān)性較強(qiáng)的疾病靶點(diǎn)后合并去重,將藥物成分作用靶點(diǎn)與2型糖尿病相關(guān)疾病靶點(diǎn)取交集處理后,得到兩者共同靶點(diǎn)。

        2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫中將共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析,選定物種為“人”,得到靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI),導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中,對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?,并按degree值分布排列。繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果篩選核心靶點(diǎn),結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取的成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù),Excel統(tǒng)計(jì)核心靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)成分,篩選得到核心成分。

        2.4 功能與通路富集 基于DAVID、Metascape富集分析工具,選定物種為“人”,進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。

        2.5 中藥-成分-靶點(diǎn)-通路構(gòu)建 將黃芪、山藥、葛根、人參成分進(jìn)行編號,成分對應(yīng)靶點(diǎn),核心靶點(diǎn)對應(yīng)通路,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)文件屬性文件,導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件,繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

        2.6 分子對接 在化學(xué)數(shù)據(jù)庫(PubChem)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(RCSB-Pdb)中檢索核心成分靶點(diǎn)與配體文件,采用Autodock Vina軟件對核心成分-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。

        3 結(jié)果

        3.1 數(shù)據(jù)挖掘 在2020年版《中國藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫中檢索到相關(guān)處方43首、中藥111味,統(tǒng)計(jì)使用頻數(shù)前20的中藥,繪制高頻中藥鏈接關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖1),鏈接強(qiáng)度為1~17,中藥的顏色越紅,表明其出現(xiàn)在處方中次數(shù)越多;不同中藥間的連線越粗,表明兩藥配伍相關(guān)性越強(qiáng)。由此可知,黃芪使用頻次最高,其次為天花粉、地黃、麥冬、山藥、枸杞子、五味子、知母、葛根、人參,排名前10的配伍藥對依次為黃芪-天花粉、黃芪-地黃、黃芪-山藥、黃芪-枸杞子、黃芪-葛根、黃芪-麥冬、黃芪-五味子、黃芪-黃精、黃芪-黃連、黃芪-人參。與糖尿病保健食品中排名前十的藥食兩用中藥[4]取交集后,優(yōu)選出黃芪、山藥、葛根、人參。

        3.2 作用靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得黃芪、山藥、葛根、人參活性成分共48個(gè),作用靶點(diǎn)92個(gè);在CTD、Gene Cards數(shù)據(jù)庫中獲得糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)共988個(gè),取交集后得到共同靶點(diǎn)56個(gè),成分-疾病靶點(diǎn)見圖2。

        3.3 PPI蛋白互作圖 在Cytoscape 3.6.1中繪制PPI圖,并按照重要性排列,按照節(jié)點(diǎn)度值(Degree)排序,篩選得到核心靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)顏色越紅、越大,表明度值越高,結(jié)果見圖3。刪除與疾病無相關(guān)性靶點(diǎn),得到11個(gè)藥物-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn),分別為AKT1、PTGS2、MAPK8、IL1B、JUN、CASP3、RELA、ICAM1、STAT1、AHR、NFKBIA,核心成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2,具體見表1。

        表1 4味藥食兩中藥核心成分

        3.4 GO功能富集 統(tǒng)計(jì)生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC),篩選出排名前10者,并繪制GO功能富集分析組圖,結(jié)果見圖4、表2。由此可知,生物過程主要涉及生物過程為對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等;分子功能主要涉及核基因編碼、蛋白質(zhì)功能等分子功能;細(xì)胞成分主要參與胞漿、核周區(qū)、膜區(qū)等定位。

        表2 GO功能富集分析結(jié)果

        3.5 KEGG通路富集 主要涉及通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路等,通路氣泡富集圖見圖5,氣泡大小代表通路上富集的基因數(shù)量,氣泡越大,表明富集的基因數(shù)目越多;氣泡顏色代表-logP值,其值由大到小從紅色到藍(lán)色變化。

        3.6 成分-靶點(diǎn)-通路構(gòu)建 通過 Cytoscape 3.6.1軟件繪制中藥-成分-靶點(diǎn)-通路圖,結(jié)果見圖6。

        3.7 分子對接驗(yàn)證 將核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2與AKT1、PTGS2、MAPK8等核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接,當(dāng)結(jié)合鍵能<-5 kcal/mol時(shí),表明兩者對接結(jié)果良好,采用R語言繪制結(jié)合鍵能熱圖,見圖7,并用Pymol繪制分子對接模型圖,見圖8~9。

        4 討論

        2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要為胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷[5]。常見降糖藥物作用途徑單一,并伴有不同程度的副作用,如導(dǎo)致低血糖、乳酸性酸中毒等問題[6]。藥食兩用中藥使用安全,降血糖作用溫和持久,兼具降脂、降壓、消炎、增強(qiáng)免疫等多種優(yōu)勢[7],具有治療2型糖尿病的重大潛能。目前2型糖尿病與低度炎癥相關(guān)性研究逐漸增多[8],且腸道菌群失調(diào)可能成為重要誘導(dǎo)2型糖尿病發(fā)生的因素。

        本研究結(jié)果表明,黃芪、山藥、葛根、人參4味藥治療2型糖尿病的核心靶點(diǎn)為AKT1、PTGS2、MAPK8等。其中,蛋白激酶(AKT)在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活,胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用,AKT1與胰島β細(xì)胞損傷修復(fù)密切相關(guān)[9];前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)參與誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)堆積,能負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素分泌,并與胰島素敏感性降低相關(guān)[10];絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)作為JNK信號通路重要調(diào)控基因[11],與胰島素抵抗密切相關(guān)。分子對接結(jié)果表明,槲皮素、山柰酚與PTGS2結(jié)合最穩(wěn)定,β-谷甾醇、人參皂苷Rh2則與MAPK8結(jié)合最穩(wěn)定,表明4味藥核心成分通過作用核心靶點(diǎn),可能減輕炎癥反應(yīng),改善胰島素抵抗來治療2型糖尿病。

        KEGG通路富集分析主要涉及AGE-RAGE、TNF等通路。AGE-RAGE信號通路能夠引發(fā)一系列炎癥,導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損和胰島素抵抗,與2型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)[12]。TNF通路中主要效應(yīng)分子為腫瘤壞死因子α(TNF-α),其與腫瘤壞死因子受體(TNFR)結(jié)合,可產(chǎn)生C-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB(NF-κB)等,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]引發(fā)胰島素抵抗。

        GO功能富集生物過程涉及脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、細(xì)胞外刺激的反應(yīng),提示糖尿病的防治可能涉及細(xì)菌來源的分子反應(yīng),而這與腸道菌群關(guān)系密切[14]。研究表明,2型糖尿病可能與腸道菌群變化及其代謝紊亂引起的低度炎癥有關(guān)[15]。機(jī)體正常情況下,以雙歧桿菌、乳桿菌為主的益生菌占優(yōu),形成菌膜結(jié)構(gòu),來抵抗病原菌對機(jī)體的侵襲[16]。而在2型糖尿病患者腸內(nèi),會出現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門增多,擬桿菌門、放線菌門減少[17],以及雙歧桿菌和乳酸桿菌減少,腸球菌和大腸桿菌增多[18]等變化。研究表明雙歧桿菌能改善高脂飲食小鼠糖耐量,降低TNF-α,IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌,減輕炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗程度[19],也可抑制腸道中常見致病菌如擬桿菌等的生長和增殖[20],發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)定及抗炎的作用。腸道菌群也能通過微生物代謝物,交叉影響宿主的代謝穩(wěn)態(tài),從而與2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)[21]。脂多糖(LPS)主要來源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁。研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者腸道內(nèi)革蘭氏陰性菌的比例增加,LPS分泌增多[22],激活NF-κB通路,促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等表達(dá)[23],以及促進(jìn)JNK的激活,從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。而且已有報(bào)道這2種途徑均與胰島素抵抗以及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[24]。此外,2型糖尿病患者腸道內(nèi),SCFAS產(chǎn)生菌尤其是丁酸產(chǎn)生菌會減少[25],而雙歧桿菌作為丁酸鹽產(chǎn)生最重要的腸道細(xì)菌之一[26],對促進(jìn)SCFAS產(chǎn)生、減輕炎癥以及降低胰島素抵抗有積極作用[27]。

        多項(xiàng)研究也表明槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2均可抑制NF-κB過度活化,減少LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用,從而改善胰島素抵抗與胰島細(xì)胞損傷[28-31]。

        綜上所述,核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2,通過作用AKT1、PTGS2、MAPK8等多靶點(diǎn),參與調(diào)控AGE-RAGE、TNF等信號通路表達(dá),可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào),改善LPS、SCFAs等代謝途徑,共同發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)、降低胰島素抵抗以及減少胰島β細(xì)胞損傷等作用,從而對2型糖尿病起到一定的治療作用。

        5 結(jié)論

        本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的分析結(jié)果,探討了成分-腸道菌群-炎癥反應(yīng)-2型糖尿病的關(guān)系,提示4味藥食兩用中藥可能通過腸道菌群對2型糖尿病起到一定的治療作用。本研究基于大數(shù)據(jù),借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法初步闡明治療2型糖尿病機(jī)制,其結(jié)果仍有待于后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,并且針對2型糖尿病的不同證型,在中醫(yī)辨證施治的指導(dǎo)下如何正確使用藥食兩用藥亦是進(jìn)一步研究的方向。

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