張 敬， 董 梁， 劉彥玲

(衡水市人民醫(yī)院，河北 衡水 053000)

膿毒血癥是全身性炎癥的指征，與內(nèi)毒素、真菌、局部缺血或再灌注或組織損傷引起的感染性侵襲有關(guān)，并與病原體成分和Toll樣受體相互作用引發(fā)的炎癥反應相關(guān)[1]，膿毒癥患者會出現(xiàn)肝損傷[1]。脂多糖(LPS)刺激庫普弗細胞釋放促炎性細胞因子[2]，調(diào)節(jié)氧化狀態(tài)并最終導致肝損傷[3]。TNF-α是內(nèi)毒素休克的主要介質(zhì)，并且還激活胱天蛋白酶依賴性凋亡信號轉(zhuǎn)導[4]，其介導的肝細胞凋亡與LPS誘導的肝損傷有關(guān)[5]。由于LPS刺激一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的合成[6]，還能激活并誘導轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)，這在肝細胞炎癥和凋亡中起關(guān)鍵作用[7]。

螺旋藻藍藻是一種藍綠色藻類，從中提取的多糖為螺旋藻多糖，由鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯吡喃糖葡萄糖醛酸組成[8-9]。螺旋藻多糖參與多種生物學功能，包括抗衰老，降低高膽固醇血癥，促進蛋白質(zhì)合成，增強免疫功能和抗輻射等，其在生物體中發(fā)揮抑制炎癥和抗氧化應激的作用[10]。因此，本研究將探索螺旋藻多糖對LPS誘導小鼠肝損傷的作用及機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 螺旋藻多糖購自三亞海王海洋生物科技有限公司。衍生自大腸桿菌(O26：B6)的脂多糖購自美國Sigma公司；蛋白質(zhì)測定試劑盒、兔抗IL-6、兔TNF-α、小鼠抗β-actin、兔和小鼠二抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗NF-κB p65、iNOS、COX-2購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物 雄性SPF級C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，購自廣州醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2018-0002，實驗動物使用許可證號SYXK(粵)2018-0002，經(jīng)廣州醫(yī)科大學動物保護委員會批準。小鼠飼養(yǎng)在溫度22 ℃條件下，提供正常飲食，適應1周后開始實驗。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 參考文獻[10]報道方法，小鼠隨機分為正常組、脂多糖組和螺旋藻多糖低、高劑量組，每組8只。螺旋藻多糖低、高劑量組灌胃給予螺旋藻多糖 25、100 mg/kg，正常組和脂多糖組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥2 d后進行造模，脂多糖組和螺旋藻多糖組腹腔注射1 mg/kg LPS，正常組腹腔注射等劑量磷酸鹽緩沖液(PBS)，12 h后處死小鼠，收集血液和肝組織。

2.2 蘇木素-伊紅染色 肝組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定，包埋在石蠟中，并依次切成5 μm厚的切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，并于顯微鏡下觀察組織病理學變化并拍照。

2.3 肝組織相關(guān)蛋白酶水平檢測 使用ALT/AST檢測試劑盒檢測血清ALT、AST活性來評估肝損傷，使用CytoTox96非放射性細胞毒性測定法檢測血清LDH活性。在等滲鹽水中清洗肝組織，吸去多余鹽水，在5%偏磷酸(20 mL/g)中勻漿，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，使用相應試劑盒檢測丙二醛(MDA)、活性氧族(ROS)、總谷胱甘肽(GSH)水平。

2.4 免疫組織化學染色檢測TNF-α、IL-6表達 將石蠟切片在65 ℃烤箱中烘烤24 h，脫蠟后用PBS沖洗，置于EDTA緩沖液中進行微波抗原修復，PBS洗滌后放入3%過氧化氫溶液中，室溫放置10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌后，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉20 min，每個切片加50 μL稀釋后的TNF-α、IL-6一抗在4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后，加50～100 μL山羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗4 ℃孵育50 min，PBS洗滌后DAB顯色，終止顯色后用蘇木精復染5 min，自來水沖洗，脫水，封片，于顯微鏡下觀察，黃色或棕色沉積即為陽性表達。

2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平 收集肝組織勻漿后取上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平。

2.6 Western blot法檢測NF-κB相關(guān)蛋白表達 將冷凍的肝組織用RIPA緩沖液裂解40 min，4 ℃下離心20 min，提取總蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，將膜與一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌4次，與結(jié)合HRP的二抗孵育45 min，TBST洗滌4次，然后使用增強的化學發(fā)光檢測試劑盒進行發(fā)光，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 螺旋藻多糖對LPS誘導小鼠肝功能及病理形態(tài)的影響 正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常；脂多糖組小鼠肝結(jié)構(gòu)喪失，部分細胞核消失，大量炎性細胞浸潤；螺旋藻多糖各劑量組均能改善肝臟結(jié)構(gòu)，見圖1A。脂多糖組小鼠血清LDH、ALT、AST活性均高于正常組(P<0.01)；與脂多糖組比較，螺旋藻多糖組劑量依賴性地降低血清LDH、ALT、AST活性(P<0.05)，見圖1B～1D。

3.2 螺旋藻多糖對LPS誘導小鼠肝組織氧化應激水平的影響 如圖2所示，與正常組比較，脂多糖組小鼠肝組織MDA、ROS水平升高(P<0.01)，GSH水平降低(P<0.01)；與脂多糖組比較，螺旋藻多糖組劑量依賴性地降低了小鼠肝組織MDA、ROS水平(P<0.05，P<0.01)，升高了GSH水平(P<0.05，P<0.01)，提示螺旋藻多糖有效改善LPS誘導的小鼠肝組織氧化應激狀態(tài)。

3.3 螺旋藻多糖對LPS誘導小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平的影響 如圖3A～3B所示，與正常組比較，脂多糖組小鼠肝組織TNF-α、IL-6陽性表達增加；與脂多糖組比較，螺旋藻多糖組TNF-α、IL-6陽性表達降低。如圖3C～3F所示，與正常組比較，脂多糖組小鼠肝組織促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平升高(P<0.01)；與脂多糖組比較，螺旋藻多糖組劑量依賴性地降低TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4 螺旋藻多糖對LPS誘導小鼠肝組織NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表達的影響 如圖4所示，與正常組比較，脂多糖組小鼠肝組織NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表達升高(P<0.01)；與脂多糖組比較，螺旋藻多糖組劑量依賴性地降低小鼠肝組織NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

螺旋藻多糖的抗氧化和抗炎特性是由于抑制NF-κB活化而引起的[11-12]。脂多糖破壞小鼠的肝臟形態(tài)并增加肝臟酶[13]。AST、ALT、LDH通常位于細胞質(zhì)中，其活性增加是肝結(jié)構(gòu)損傷的標志[14]。由于休克或壞死，厭氧條件下肝細胞會產(chǎn)生過量的LDH，血清AST、ALT、LDH活性升高，肝組織產(chǎn)生空泡、肝結(jié)構(gòu)喪失、細胞壞死[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖預處理可減少LPS誘導的肝組織形態(tài)異常和肝酶升高。LPS可以降低肝臟的抗氧化能力，并導致氧化應激和肝損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS耗盡了具有過氧化氫和過氧化物酶清除活性的GSH等抗氧化劑。超氧化物歧化酶與ROS增加有關(guān)，并防止氧化應激引起的細胞損傷[17]。此外，螺旋藻多糖預處理增加了小鼠肝組織GSH水平。敗血癥與全身性炎癥反應和抗炎失衡有關(guān)，這種失衡引起不可逆器官損傷[14]。LPS可增強炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖減弱了這些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，通過減少氧化應激和抗炎反應來保護LPS誘導的肝損傷。由此推測，螺旋藻多糖可能會是促炎基因的調(diào)節(jié)劑。NF-κB的下調(diào)抑制敗血癥期間的炎癥和肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖抑制了小鼠肝組織NF-κB及相關(guān)蛋白的表達。

綜上所述，螺旋藻多糖在LPS誘導的小鼠肝損傷模型中起到保護肝臟的作用，可能是由其下調(diào)炎癥、氧化、凋亡信號的能力介導的，可以為螺旋藻多糖作為LPS誘導的肝損傷的預防性用藥提供參考。