杜義龍， 田孟堯， 李艷榮， 洪 霞， 趙勝男， 潘海峰

(河北省承德醫(yī)學(xué)院/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

山楂葉具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效[1]，富含黃酮類、多糖類、三萜類等多種化合物，其中黃酮為活性物質(zhì)[2-6]。以山楂葉黃酮為主要成分的心安膠囊、益心酮片等制劑已廣泛應(yīng)用于臨床[7-9]，目前已從中分離鑒定出牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素等成員，具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降血糖等作用[10-15]。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素4種黃酮的提取工藝，以期為該藥材開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀(配置四元泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、Chemstation色譜工作站，美國Agilent公司)；AG-245型電子分析天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；JA5003型電子天平(1 mg，天津天馬衡基儀器有限公司)；KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。牡荊素葡萄糖苷(批號20042350)、牡荊素鼠李糖苷(批號18060103)、金絲桃苷(批號19103001)、異槲皮素(批號18062702)對照品均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。山楂葉采自河北省承德市隆化縣荒地大后溝村，經(jīng)承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為正品，標(biāo)本(編號HBCD-3-11)保存于承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所。色譜純乙腈(美國Fisher Scientific公司)；色譜純甲醇(美國Mreda Technology公司)；分析純甲酸(美國ROE公司)；分析純甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水(天津娃哈哈宏華振飲料有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.4%甲酸(A)-乙腈(B)-四氫呋喃(C)，梯度洗脫(0～15 min，5%～7%B，4%C；15～22 min，7%～12%B，4%～2%C；22～30 min，12%～14%B，2%C；30～45 min，14%B，2%C；45～50 min，14%～28%B，2%～4%C；50～55 min，28%B，4%C；55～65 min，28%～85%B，4%C～0)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長350 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、異槲皮素對照品適量，50%甲醇溶解并定容，即得(四者質(zhì)量濃度分別為297.4、409.6、255.8、117.6 μg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末(過80目篩)約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 取供試品、對照品、空白溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各黃酮分離度良好，空白無干擾。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量，50%甲醇依次稀釋2、4、8、16、32、64、128倍，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各黃酮在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各黃酮線性關(guān)系

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得各黃酮峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各黃酮含量RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各黃酮峰面積RSD均小于3.0%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取6份各黃酮含量已知的藥材約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入對照品牡荊素葡萄糖苷1.715 3 mg、牡荊素鼠李糖苷3.078 4 mg、金絲桃苷0.902 41 mg、異槲皮素0.297 62 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各黃酮平均加樣回收率(RSD)分別為牡荊素葡萄糖苷101.12%(0.77%)、牡荊素鼠李糖苷101.08%(1.5%)、金絲桃苷101.70%(3.7%)、異槲皮素101.11%(2.3%)。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 料液比 取藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱定，分別加入60%甲醇25、50、80、100、150、200 mL，超聲提取30 min，自然冷卻至室溫，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各黃酮總提取率分別為0.985%、0.993%、0.989%、0.952%、0.950%、0.946%，可知隨著料液比增加總提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在1∶50時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇1∶25、1∶50、1∶80進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.5.2 甲醇體積分?jǐn)?shù) 取藥材粉末4份，每份約1 g，精密稱定，分別加入30%、60%、90%、100%甲醇各50 mL，超聲提取30 min，自然冷卻至室溫，相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各黃酮總提取率分別為0.809%、0.982%、0.888%、0.519%，可知隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在60%時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇30%、60%、90%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.5.3 超聲時(shí)間 取藥材粉末5份，每份約1 g，精密稱定，加入60%甲醇50 mL，分別超聲提取20、25、30、35、40、45 min，自然冷卻至室溫，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各黃酮總提取率分別為0.994%、0.995%、1.01%、0.995%、0.955%、0.915%，可知隨著超聲時(shí)間延長，提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在30 min時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇25、30、35 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間(A)、料液比(B)、甲醇體積分?jǐn)?shù)(C)作為影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，各黃酮總提取率(Y)作為評價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見表2。

通過Design-Expert12.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得方程為Y=1.09+0.000 5A-0.001 9B+0.005 4C+0.006 7AB-0.000 9AC+0.004 5BC-0.010 1A2-0.014 7B2-0.105 5C2，方差分析見表3。由此可知，模型P<0.01，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，表明結(jié)果基本不受未知因素的干擾，模型擬合度良好；決定系數(shù)R2為0.966 3，校正決定系數(shù)Radj2為0.922 9，表明模型表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于響應(yīng)值預(yù)測；變異系數(shù)(CV)[16]為1.55%，表明模型方程置信度高，可用于分析響應(yīng)值變化[17]；各因素影響程度依次為甲醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時(shí)間。

表2 因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見圖2～4，可知在超聲時(shí)間25～35 min，料液比1∶30～1∶70；或超聲時(shí)間25～35 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%～70%；或料液比1∶30～1∶70，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%～70%時(shí)，各黃酮均可被最大程度地提取出來，即總提取率有相應(yīng)的最大值，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，并且均不受其他因素的影響，表現(xiàn)為簡單非線性關(guān)系。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 12.0軟件，得到最優(yōu)工藝為超聲時(shí)間30.038 min，料液比1∶48.193，甲醇體積分?jǐn)?shù)60.722%，各黃酮總提取率為1.086%，根據(jù)實(shí)際操作的可行性，將其修正為超聲時(shí)間30 min，料液比1∶50，甲醇體積分?jǐn)?shù)60%。在上述優(yōu)化工藝下進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總提取率分別為1.135%、1.135%、1.122%，平均值1.130%，與預(yù)測值1.086%接近，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論與結(jié)論

指標(biāo)成分的充分提取是保證中藥定量分析準(zhǔn)確性的重要前提，影響中藥成分提取率的因素較多，提取溶劑的種類及濃度、料液比、提取時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)對甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶劑進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示甲醇提取液獲得的色譜峰更多、峰面積更大，故選擇甲醇作為提取溶劑。

通過對照品比對發(fā)現(xiàn)，保留時(shí)間為15 min的色譜峰為綠原酸，其分離度好，峰面積大，滿足色譜定量的要求，藥理作用確切。但料液比考察結(jié)果顯示，綠原酸提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，可能該成分是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個(gè)不穩(wěn)定部分，在提取過程中會因水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化，其結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定。因此，為提高評價(jià)指標(biāo)的可信度，沒有將綠原酸作為定量指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉中4種黃酮提取工藝，避免了單一因素評價(jià)造成的局限性，也為該藥材質(zhì)量控制研究及功能成的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。