周 強， 袁明昊， 曾 彬， 魏靄玲， 周 濤， 雷苛露， 葉 強， 郭 力

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色資源國家重點實驗室，四川 成都 611137)

鹿茸是傳統(tǒng)名貴中藥，為鹿科動物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿尚未骨化的幼角[1]，含有氨基酸、多肽、多糖、核苷、激素、無機元素等成分[2-3]，在骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)方面均有良好療效[4-5]，但市場上有用馴鹿茸、狍鹿茸、花馬雜交鹿茸充當(dāng)梅花鹿茸、馬鹿茸，甚至用馬鹿茸充當(dāng)梅花鹿茸，這種以假亂真、以次充好的現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致鹿茸質(zhì)量難以控制[6-7]。課題組前期采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別手段[8]鑒定出6種鹿茸，鹿茸中含有豐富的有機、無機成分[9-15]，但尚無有以無機元素為指標(biāo)進(jìn)行鑒別的報道。因此，本實驗采用靈敏度高、測定速度快、譜線簡單、干擾較少的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定49批鹿茸中20種無機元素含量，并結(jié)合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，以期用于不同種類、等級該藥材的鑒別，也可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

ETHOS.SE微波消解儀(意大利Milestone公司)；ICAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)(美國賽默飛公司)；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；ZYCGF-II-10T卓越超純水機(四川卓越水處理設(shè)備有限公司)。

混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(BWT30101-N-100，批號B21070048，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)，質(zhì)量濃度分別為Na、Mg、K、Ca 400 μg/mL，F(xiàn)e 100 μg/mL，Sr 20 μg/mL，Ti、Cu、Mn、Zn、Ba 10 μg/mL，Li、Tl、Pb、As、Co、V、Cr 1 μg/mL，Mo、Cd 0.1 μg/mL，使用前稀釋至所需質(zhì)量濃度。65%濃硝酸為分析純(德國默克公司)。49批鹿茸由成都晶博生物科技有限公司(原四川省中藥材公司都江堰養(yǎng)鹿場)提供，保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末(過2號篩)0.25 g，置于消解罐中，依次加入7.0 mL濃硝酸、1.0 mL超純水，將消解罐放入微波消解儀中，條件見表2，消解完后取出，放到電熱板上趕酸至1 mL，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，超純水混勻[16]，即得。

表2 微波消解條件

2.2 ICP-MS測定條件 等離子體功率1 550 W，體積流量14.0 L/min；輔助氣體積流量0.8 L/min；霧化室溫度2.7 ℃；蠕動泵轉(zhuǎn)速40 r/min；采樣深度5 mm；重復(fù)次數(shù)3次。

2.3 數(shù)據(jù)處理 通過SIMCA 14.1軟件建立不同等級、品種鹿茸的OPLS-DA判別模型，采用Origin 2021 b軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 無機元素含量測定 表3顯示，Na、K、Mg、Ca等常量元素含量較高，約占總無機元素含量的90%以上；微量元素中Fe、Ti、Zn、Sr、Ba含量較高，Cr、Mn、Mo、Cu含量較低；Cd、Pb、V、As等重金屬元素均未檢出；不同種類、等級鹿茸中總無機元素含量均有差異，其高低與藥材骨化程度密切相關(guān)，與文獻(xiàn)[17-18]報道相符。

表3 各無機元素含量測定結(jié)果(mg/g)

3.2 模型建立

3.2.1 2020年版《中國藥典》收載與未收載鹿茸的區(qū)分 梅花鹿茸與馬鹿茸收載于2020年版《中國藥典》，而馴鹿茸、花馬鹿茸等均未被收載。OPLS-DA[19]測得累積解釋能力參數(shù)R2X為0.922，R2Y為0.896，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.838，表明模型穩(wěn)定可靠。圖1顯示，49批樣品分為2類，S8～S15、S26～S30、S36～S49為1類，其他鹿茸為1類，兩者區(qū)別顯著；變量投影重要性(VIP)值大于1者為Ca、Mg、Ti、Zn、Mn、Cr，即對模型分組的貢獻(xiàn)較大；置換驗證R2為0.896，其截距為0.145，而Q2為0.837，其截距為-0.569，表明模型無過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

3.2.2 梅花鹿茸與馬鹿茸的區(qū)分 對樣品S8～S15、S26～S30、S36～S49中無機元素含量進(jìn)行OPLS-DA分析，測得R2X為0.825，R2Y為0.993，Q2為0.985，表明模型穩(wěn)定可靠。圖2顯示，20批樣品可分為2類，S8～S15為1類(梅花鹿茸)，S26～S30、S36～S49為1類(馬鹿茸)；VIP值大于1的無機元素為K、Na、Cu、Zn、Ba，即對模型分組的貢獻(xiàn)較大；置換驗證R2為0.993，其截距為0.197，而Q2為0.985，其截距為-0.768，表明模型無過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

3.2.3 同一種類不同等級鹿茸的區(qū)分 采用OPLS-DA測得R2X為0.632，R2Y為0.543，Q2為0.50，表明模型穩(wěn)定可靠。圖3顯示，19批馬鹿茸可分為3類，S26、S30、S36～S38為1類(臘片)，S42～S47為1類(血片、粉片)；S27～S29、S48～S49為1類(骨片、角片)，其中血片和粉片、骨片和角片的分布空間相近；VIP值大于1的無機元素為Na、Mg、Ba、Sr、Ti，即對模型分組的貢獻(xiàn)較大；R2為0.947，其截距為0.117，而Q2為0.803，其截距為-5.19，表明模型無過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

3.2.4 不同種類鹿茸的區(qū)分 采用OPLS-DA測得R2X為0.874，R2Y為0.661，Q2為0.61，表明模型穩(wěn)定可靠。圖4顯示，49批樣品可分為6類，S1～S7為1類(馴鹿茸)，S8～S15為1類(梅花鹿茸)，S21～S25為1類(狍鹿茸)，S26～S30、S36～S49為1類(馬鹿茸)，S16～S20(花馬鹿茸)、S31～S35(麋鹿茸)空間分布距離較近，各為1類；VIP值大于1的無機元素為Na、Cu、K、Mn、Cr、Ba、Sr；R2為0.990，其截距為0.023，而Q2為0.987，其截距為-0.332，表明模型無過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

4 討論與結(jié)論

課題組前期曾對49批鹿茸中無機元素含量進(jìn)行主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果較差，6種鹿茸分布較散亂。再采用偏最小二乘回歸分析(PLS-DA)，發(fā)現(xiàn)不同品種藥材已出現(xiàn)較明顯的分類趨勢，但分布不夠集中。OPLS-DA可去除無關(guān)聯(lián)的噪音變量，具有更好的可解釋性，故本實驗采用該方法進(jìn)行鑒別。

鹿茸種類較多，市場上常將馴鹿茸、花馬雜交鹿茸等未被2020年版《中國藥典》收載的品種充當(dāng)梅花鹿茸等藥典收載的品種來謀取暴利，本實驗通過OPLS-DA實現(xiàn)了區(qū)分。梅花鹿茸、馬鹿茸雖然均為藥典收載品種，但前者市場價格遠(yuǎn)高于后者，故后者充當(dāng)前者的現(xiàn)象較嚴(yán)重，故有必要通過OPLS-DA對兩者進(jìn)行區(qū)分。同種鹿茸之間由于等級不同(臘片、粉片與血片、角片與骨片)，價格差別較大，但粉片與骨片、角片與骨片之間沒有明確限定，?；鞛橐活悾鳲PLS-DA能對其進(jìn)行較好的區(qū)分。除此之外，OPLS-DA還可用于不同種類鹿茸的區(qū)分。

綜上所述，本實驗通過ICP-MS結(jié)合OPLS-DA實現(xiàn)了對不同種類、等級鹿茸的鑒別，可為其他動物角類藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。