吳夢玫， 馬舒婷， 鐘楚楚， 吳孟華,3， 張 英,3， 曹 暉,3， 馬志國,3*

(1.暨南大學嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心，廣東 廣州 511400；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心嶺南資源分中心，廣東 廣州 511400；3.廣東省中醫(yī)藥信息化重點實驗室，廣東 廣州 511400)

柑橘屬植物是臨床常用理氣類藥材的重要來源[1]，2020年版《中國藥典》一部收載的枳實、枳殼、青皮、陳皮、化橘紅、佛手等藥材的基原植物均來自該屬[2]，含有黃酮、香豆素、萜類、生物堿等成分[3]，其中柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素等黃酮是一類重要的活性物質(zhì)[4-6]，對其成分分析是單一藥材的不同商品規(guī)格，或2種基原一致、采收期不同藥材的多指標定性定量分析與指紋圖譜對比[7-12]，文獻[13]采用HPLC法對6種柑橘屬藥材指紋圖譜同時進行比較，并初步將其分為柚皮苷型、橙皮苷型，但批次較少，而且未對主要成分色譜峰的結(jié)構(gòu)類型和分布規(guī)律進行系統(tǒng)分析。因此，本實驗建立枳實、枳殼、青皮、陳皮、化橘紅5種柑橘屬藥材的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合化學計量學分析其基原與黃酮結(jié)構(gòu)類型的相關(guān)性，以期為該屬藥材的品種鑒別和質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，配置G7115A型DAD檢測器、G7129A自動進樣器和柱溫箱、G7111A在線真空脫氣機(美國Agilent公司)；FA2204B電子天平(萬分之一，上海佑科儀器儀表有限公司)；EX225DZH電子天平(十萬分之一，美國奧豪斯儀器有限公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

新北美圣草苷(批號X-080-181219)、蕓香柚皮苷(批號Y-071-180917)、柚皮苷(批號Y-006-171216)、新橙皮苷(批號X-010-171216)、香蜂草苷(批號X03402001007)、枳屬苷(批號G-019-171216)、川陳皮素(批號C-015-180306)、桔皮素(批號J-022-180730)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于97.0%；橙皮苷(批號BBP00425)對照品購自云南西力生物技術(shù)有限公司，純度大于98.0%。乙腈、甲酸均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為華潤怡寶純凈水。

枳實、枳殼、青皮、陳皮、化橘紅共62批，經(jīng)暨南大學藥學院馬志國教授鑒定為正品，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，15%B；10～15 min，15%～20%B；15～20 min，20%～25%B；20～30 min，25%～40%B；30～40 min，40%～50%B；40～50 min，50%～60%B；50～60 min，60%～65%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長283 nm；進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 取干燥藥材粉末(過5號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲(功率700 W，頻率40 kHz)處理30 min，放冷，50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液(ZQ-1)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，以新橙皮苷(5號峰)為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(ZQ-1)，于0、2、4、8、12、16、20、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以新橙皮苷(5號峰)為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于0.7%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批藥材(ZQ-1)，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以新橙皮苷(5號峰)為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 圖譜建立 取各批藥材粉末(過5號篩)適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，所得圖譜以AIA格式導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012年版)”，見圖1，并計算相似度，見表2，可知藥材相似度較高，質(zhì)量穩(wěn)定。另外，基原均為酸橙的枳殼、枳實(酸橙)HPLC指紋圖譜基本一致，均為橘成熟期不同的青皮、陳皮與枳實(甜橙)HPLC指紋圖譜基本一致，為化州柚或柚的化橘紅與其他藥材HPLC指紋圖譜的差異明顯。

表2 7批樣品相似度

2.4 共有峰指認 精密稱取新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷、枳屬苷、川陳皮素、桔皮素對照品適量，置于量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，得到不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2。通過比對保留時間、紫外光譜圖、對照品，共指認出9個共有峰，其中川陳皮素、桔皮素為黃酮苷元，其他7種為黃酮苷，并且蕓香柚皮苷與柚皮苷、橙皮苷與新橙皮苷、香蜂草苷與枳屬苷互為同分異構(gòu)體。

2.5 共有峰化學類型分析 新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷所連接糖基均為蕓香糖，由鼠李糖(1，6)葡萄糖構(gòu)成；柚皮苷、新橙皮苷、枳屬苷所連接糖基均為新橙皮糖，由鼠李糖(1，2)葡萄糖構(gòu)成，故可將上述成分分為新橙皮糖型、蕓香糖型，而且在不同藥材中呈現(xiàn)一定的分布規(guī)律。另外，新橙皮糖型黃酮苷是以酸橙為植物基原的枳殼、枳實(酸橙)及以柚為植物基原的化橘紅中最主要的黃酮苷類成分，而蕓香糖型黃酮苷以是甜橙和橘為植物基原的枳實(甜橙)、青皮、陳皮中最主要的黃酮苷類成分，故根據(jù)5種柑橘屬藥材HPLC指紋圖譜的差異和共有峰的分布特點，可將其分為新橙皮糖型[枳殼、枳實(酸橙)、化橘紅]、蕓香糖型[枳實(甜橙)、青皮、陳皮]。

2.6 主成分分析(PCA) 將9個共有峰峰面積值輸入SIMCA 14.1軟件，對數(shù)據(jù)進行標準化處理，模型自動提取4個主成分，以綜合特征值大于1、貢獻率大于85%為標準[14]，當提取前4個主成分時，特征值均大于1，累積貢獻率大于85%，累積模型解釋率R2X為0.900，累積模型預測能力Q2X為0.618，即模型可解釋90.0%的原始信息，而且R2X、Q2X均大于0.500，表明模型預測性良好，穩(wěn)定可靠。以各藥材批次為觀察值，提取前2個主成分，使樣品多維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成二維數(shù)據(jù)，從而簡化樣本信息，見圖3～4。

由圖3可知，5種藥材分為2類，枳實(甜橙)、青皮、陳皮為1類，即蕓香糖型；枳殼、枳實(酸橙)、光橘紅、毛橘紅為1類，即新橙皮糖型。由于4種新橙皮糖型藥材所含成分種類和含量差異較大，故又可進一步分為2組，即枳殼、枳實(酸橙)組和光橘紅、毛橘紅組。

PCA載荷圖中每種成分都對應(yīng)1個點，載荷反映了變量與主成分之間的相關(guān)性，得分圖中的標識與載荷圖中相同位置分布的標識成正相關(guān)，與相反位置分布的標識呈負相關(guān)[15]。由圖4可知，枳實(甜橙)、青皮、陳皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷等成分貢獻率大，枳殼、枳實(酸橙)中新北美圣草苷、枳屬苷、新橙皮苷等成分貢獻率大，光橘紅、毛橘紅中未知峰10、11等成分貢獻率大，柚皮苷在枳殼、枳實(酸橙)及光橘紅、毛橘紅中等成分貢獻率大。

3 討論

本實驗首次建立5種柑橘屬藥材HPLC指紋圖譜，并對其主要特征峰進行了指認，發(fā)現(xiàn)均一性較高，質(zhì)量穩(wěn)定，部分基原植物相同或相近的藥材之間成分差異??；新北美圣草苷(1號峰)是枳殼、枳實(酸橙)特有峰，柚皮苷是化橘紅中含量最高的成分，川陳皮素(7號峰)、桔皮素(8號峰)是區(qū)分化橘紅與其他4種同屬藥材的特征成分；在2種規(guī)格的化橘紅中，10號峰是區(qū)分光橘紅與毛橘紅的特征成分，可能是橙皮內(nèi)酯水合物，而11號峰可能是柚皮素[12]。主成分分析結(jié)果顯示，可將主要含新橙皮糖型黃酮苷的枳殼、枳實(酸橙)、光橘紅、毛橘紅與主要含蕓香糖型黃酮苷的青皮、陳皮、枳實(甜橙)分為2類，同屬枳殼、枳實(酸橙)與光橘紅、毛橘紅又可被進一步分為2類。

黃酮為柑橘屬藥材主要成分，是以C6-C3-C6為骨架的一類化合物為基本母體衍生的化合物，大多以苷類形式存在，其中組成黃酮苷的糖類主要有D-葡萄糖、D-半乳糖、龍膽二糖、蕓香糖、新橙皮糖等，組成蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷的糖均為由鼠李糖(1，6)葡萄糖構(gòu)成的雙糖蕓香糖，組成新北美圣草苷、柚皮苷、新橙皮苷、枳屬苷的糖均為由鼠李糖(1，2)葡萄糖構(gòu)成的雙糖新橙皮糖。糖基不同的2類成分在柑橘屬藥材中的分布具有一定的規(guī)律，蕓香糖型黃酮苷主要分布在枳實(甜橙)、青皮、陳皮中，而新橙皮糖型黃酮苷主要分布在枳殼、枳實(酸橙)、化橘紅中。

柑橘屬植物最大的特點是可進行種間雜交，故其品種繁多，但大多來源于橘、柚、香櫞，其中化橘紅基原為柚，陳皮、青皮基原為橘，枳殼、枳實(酸橙)基原為酸橙，枳實(甜橙)基原為甜橙，酸橙、甜橙的2個親本都是柚類與橘類，并且前者是由橘(父本)和柚(母本)一次雜交形成[11]，而后者是柚的基因持續(xù)不斷滲入橘的基因組形成，在此過程中發(fā)生了多次雜交，由于一定程度上人工馴化選擇，最終其親本主要貢獻度來自于橘類。因此，枳實(甜橙)HPLC指紋圖譜與來源于橘的青皮、陳皮基本一致，而與來源于酸橙的枳殼、枳實(酸橙)差異明顯。