姚世霞， 劉東升， 牛鈺婷， 朱旭江， 劉志浩， 朱 琳

(甘肅省藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材飲片質(zhì)量控制重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

荊防顆粒由荊芥、防風、柴胡、川芎、羌活、獨活、前胡等11味藥材組成，具有發(fā)汗解表、散風祛濕的功效[1]，來源于《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散[2]，方中荊芥、防風，散風解表，為君藥；羌活、獨活散風去濕，柴胡升清透表，川芎行血祛風，共為臣藥；桔梗、枳殼、前胡、茯苓分別有開肺、降氣、祛痰、滲濕之效，共為佐藥；甘草和中調(diào)藥，兼助益氣，為使藥[3-5]。新冠肺炎疫情發(fā)生以來，荊防敗毒散及其同方制劑荊防顆粒多地列入推薦群體性預防和治療的藥物[6-9]，該制劑現(xiàn)行標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準第二冊》，但僅有性狀與常規(guī)檢查項，不能滿足其質(zhì)量控制要求。因此，本實驗建立HPLC法同時測定荊防顆粒中升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量，并采用聚類分析、主成分分析對7家廠家88批樣品進行考察，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ME204(萬分之一)、MS205DU(十萬分之一)電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 升麻素苷(批號111522-201712，純度96.2%)、橙皮苷(批號110721-201617，純度96.1%)、紫花前胡苷(批號110821-201604，純度99.6%)、柚皮苷(10722-201815，純度91.7%)、新橙皮苷(批號111857-201804，純度99.4%)、蛇床子素(批號110822-201710，純度99.5%)、白花前胡甲素(批號111711-201904，純度99.4%)對照品(中國藥品食品檢定研究院)；蕓香柚皮苷對照品(批號P29M6R4，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；亥茅酚苷對照品(批號DST200306，純度≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司)。荊防顆粒共88批，來自2020年國家評價性抽樣，涉及7家廠家。乙腈為色譜純(德國默克公司)；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～4 min，10%A；4～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～45 min，20%～40%A；45～58 min，40%～80%A；58～73 min，80%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm(升麻素苷、亥茅酚苷)、280 nm(蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)、320 nm(紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素)。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品升麻素苷21.44 mg、亥茅酚苷14.26 mg、蕓香柚皮苷9.14 mg、柚皮苷23.72 mg、新橙皮苷17.06 mg、橙皮苷19.25 mg、紫花前胡苷14.99 mg、蛇床子素19.34 mg、白花前胡甲素14.11 mg，甲醇溶解，即得(質(zhì)量濃度分別為8.25、11.41、35.83、87.00、37.02、67.83、7.70、59.72、11.22 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研細，精密稱取10 g，置于帶塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，80 ℃水浴回流提取2 h，晾至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例和工藝分別制備不含防風、前胡、羌活、獨活、枳實的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適應性試驗及專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1～3。由此可知，供試品溶液中顯示出與對照品溶液中對應成分保留時間相同的色譜峰，分離度良好，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取1、2、5、10、15、20、30 μL對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)進行回歸，再以信噪比(S/N)3∶1為檢出限，10∶1為定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.7 精密度試驗 取對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面積RSD分別為1.4%、1.3%、0.6%、0.8%、1.3%、0.5%、0.7%、1.8%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面積RSD分別為0.8%、1.3%、0.6%、1.4%、0.9%、1.2%、1.3%、0.9%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗 取本品(廠家C，批號0011901012)適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量RSD分別為3.1%、3.3%、1.5%、1.7%、1.9%、1.5%、2.8%、3.2%、3.3%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取本品(廠家C，批號0011901012)適量，置于錐形瓶中，分別按50%、100%、150%水平精密加入對照品溶液各3份，共9份，氮氣吹干溶劑，精密加入本品5 g，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素平均加樣回收率分別為92.9%、91.5%、92.4%、94.5%、94.0%、96.5%、92.1%、93.4%、92.9%，RSD分別為1.9%、1.7%、2.1%、1.8%、1.4%、1.1%、3.0%、2.8%、2.3%。

2.11 樣品含量測定 取不同廠家、批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果

2.12 化學計量學研究

2.12.1 聚類分析 采用SPSS 23.0軟件對表2結(jié)果進行聚類分析，以平均歐式距離為標準，轉(zhuǎn)換值標準化選擇Z得分，結(jié)果見圖4。由此可知，各廠家聚為3類，B、D、E為1類，A、C聚為1類，F(xiàn)、G為1類。

2.12.2 主成分分析 采用SPSS 23.0軟件進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)前2個主成分特征值均大于1，累積方差貢獻率達89.11%，故以其代替9個變量，結(jié)果見表3、圖5。由此可知，亥茅酚苷、白花前胡甲素、紫花前胡苷、蛇床子素、升麻素苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷含量在第一主成分中的載荷值較高，蛇床子素、升麻素苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷含量在第二主成分中的載荷值較高，以各成分因子得分乘以對應特征值的算術(shù)平方根為主成分得分F1、F2，以其方差貢獻率占累積方差貢獻率的比例為權(quán)重，計算綜合得分F，公式為F=(49.924F1+39.184F2)/89.108。結(jié)果，不同廠家樣品綜合得分依次為F>G>C>A>D、B、E(后三者得分接近)，與聚類分析結(jié)果一致。

表3 總方差解釋

2.12.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA) 將表2結(jié)果導入SIMCA 14.1軟件，建立PLS-DA模型[10]，結(jié)果見圖6，可知數(shù)據(jù)矩陣的結(jié)實率參數(shù)R2X為0.99，模型區(qū)分參數(shù)R2Y為0.79，模型預測參數(shù)Q2為0.76，均大于0.50，表明模型穩(wěn)定性、預測性均較好。再提取9個變量的重要性投影值(VIP)，見圖7，以VIP>1為標準，得到質(zhì)量差異標志物為柚皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蕓香柚皮苷。

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇 在2020年版《中國藥典》一部中，防風、前胡、羌活、獨活、枳實均以甲醇為提取溶劑。本實驗分別對超聲、回流提取進行考察，發(fā)現(xiàn)回流后各成分純度高于超聲后，并且在2 h時保持穩(wěn)定。最終確定，樣品提取方法為50 mL甲醇回流2 h。

3.2 檢測波長選擇 本實驗發(fā)現(xiàn)，各成分紫外最大吸收波長分別為升麻素苷250、296 nm，亥茅酚苷299 nm，蕓香柚皮苷282 nm，柚皮苷282 nm，橙皮苷282 nm，新橙皮苷283 nm，紫花前胡苷334 nm，蛇床子素320 nm，白花前胡甲素321 nm。綜合考慮，確定檢測波長分別為升麻素苷、亥茅酚苷254 nm，柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷280 nm，紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素320 nm。

3.3 指標成分確定 荊防顆粒中枳殼含有蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[11]，防風含有升麻素苷、亥茅酚苷[12]，前胡、羌活含有紫花前胡苷、白花前胡甲素[13-14]，獨活含有蛇床子素[15]。因此，本實驗選擇上述成分作為指標。

4 結(jié)論

隨著荊防顆粒在治療新冠肺炎中的應用越來越廣泛[16-18]，加強該制劑質(zhì)量控制刻不容緩。本實驗建立HPLC法同時測定荊防顆粒中升麻素苷、亥茅酚苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素的含量，該方法專屬性強，重復性、準確性良好，穩(wěn)定可靠，可為相關(guān)生產(chǎn)廠家加強質(zhì)量控制和優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供參考。