李素麗 曹嵐嵐周泉程雪梅楊濤周華?王長虹?

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所， 上海市復方中藥重點實驗室， 中藥標準化教育部重點實驗室， 上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中西醫(yī)結合心血管病研究所， 上海201203）

鹿紅方是具有治療慢性心力衰竭作用的驗方，由鹿角、紅花、淫羊藿、補骨脂、山茱萸、女貞子、沉香7 味藥材組成［1?2］，以傳統(tǒng)水煎劑形式應用于臨床，存在使用不便等缺點。因此，有必要將鹿紅方研制成固體劑型（如顆粒劑等），以便臨床使用。

在中藥復方提取工藝綜合評價過程中，多重評價指標權重系數(shù)合理性會對結果會產生較大影響，計算權重的方法一般分為主觀賦權法、客觀賦權法，并且大多采用多指標評價體系權重賦分［3］，其中G1 法是對層次分析法進行改進的主觀賦權法，具有計算速度快、無需一致性檢驗等優(yōu)點［4］；熵權法作為客觀賦權法可與其他方法組合使用［5］。課題組前期建立了鹿紅方水煎劑中羥基紅花黃色素A、沒食子酸、沉香四醇、馬錢苷、異補骨脂苷、補骨脂苷、特女貞苷7 種主要活性成分含量的測定方法［6］，本實驗采用星點設計?響應面法結合G1?熵權法優(yōu)化鹿紅方顆粒提取工藝，以期為該制劑臨床合理應用提供參考。

1 材料

Agilent 1100 高效液相色譜 儀（美國 Agilent Technologies 公司）；BT25S（十萬分之一）、BSA124S?CW（萬分之一）電子分析天平（德國賽多利斯公司）；DRT?TW 電熱套（鄭州長城科工貿有限公司）。羥基紅花黃色素A（批號AF9081601）、異補骨脂苷（批號AF9102108）、補骨脂苷（批號AF9102107）、馬錢苷（批號AF7110703）對照品均購于上海鴻永生物科技有限公司，純度均大于98%；特女貞苷（批號2018011201）對照品購于成都普利斯生物科技有限公司，純度大于98%；沒食子酸（批號DST190715?008）、沉香四醇（批號DST190801?042）對照品均購于成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司，純度均大于98%。鹿角、紅花、淫羊藿、補骨脂、女貞子、山茱萸、沉香飲片均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定為正品。甲酸為色譜純（批號G0960200，上海安譜科學儀器有限公司）；乙腈為色譜純（美國Thermo 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 參考文獻［6］ 報道，ZORBAX SB?Aq 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?0.1% 磷酸，梯度洗脫（0～10 min，5% 乙腈；10～15 min，5%～10%乙腈；15～35 min，10%～18%乙腈；35～40 min，18%～25%乙腈；40～60 min，25%～35%乙腈）；體積流量1.0 mL／min；柱 溫30 ℃；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A、沒食子酸、沉香四醇、馬錢苷、異補骨脂苷、補骨脂苷、特女貞苷對照品適量，甲醇稀釋定容至刻度，即得。

2.3 供試品溶液制備 按處方量取藥材約125 g（鹿角15 g、紅花9 g、淫羊藿30 g、補骨脂20 g、女貞子30 g、山萸肉15 g、沉香6 g），精密稱定，采用Design?Expert 10.0 軟件設計出的方案進行煎煮，濾過，濾液減壓濃縮至1 000 mL，得到鹿紅方水煎劑，取適量用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 評價指標組合賦權 依據(jù)功效相關物質及復方“君臣佐使”配伍原則，分別采用主觀賦權（G1 法）、客觀賦權（熵權法）對羥基紅花黃色素A、沒食子酸、沉香四醇、馬錢苷、異補骨脂苷、特女貞苷、補骨脂苷含量及干浸膏得率進行組合賦權。

2.4.1 G1法參考文獻［7?9］ 報道，具體步驟如下。

（1）確定各評價指標重要順序，根據(jù)其相對于某評價準則的順序關系，記為x1＞x2＞…＞xa［10］。

（2）根據(jù)重要程度之比進行理性賦值，將xk－1、xk重要性程度之比的相對重要程度記為rk［10］，即權重評價標度的理性判斷，公式為rk＝ωk－1／ωk，k＝a，a－1，…，2。

（3）計算權重系數(shù)ωk［10］，公式為ωk ＝（1＋＝r2r3…rk＋r3r4…rk＋…＋rk。

結果，各評價指標重要性程度依次為羥基紅花色素含量＞馬錢苷含量＞補骨脂苷含量＝異補骨脂苷含量＝沒食子酸含量＝特女貞苷含量＞浸膏得率含量＞沉香四醇含量，根據(jù)理性賦值將其權重評價標度定為r2＝1.1、r3＝1.5、r4＝1、r5＝1、r6＝1、r7＝1.4、r8＝1.3，主觀權重分別為ω1＝0.196 2、ω2＝0.178 3、ω3＝0.118 8、ω4＝0.118 8、ω5＝0.118 8、ω6＝0.118 8、ω7＝0.084 9、ω8＝0.065 4。

2.4.2 熵權法 參考文獻［7］ 報道，具體步驟如下。

（1）對原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化處理，原始矩陣為xij（其中有j個評價指標、i個評價對象），將其進行歸一化處理，即rij＝（xij－xjmin）／（xjmax－xjmin），其中xij為第i個對象的第j項評價指標數(shù)據(jù)，xjmax、xjmin分別為xij的最大值、最小值，i＝1，2，…，b，j＝1，2，…，a［7］。

（2）根據(jù)特征比重求取指標熵值sj［11］，公式為sj ＝，其 中（當fij＝0時，xijlnb＝0）。

（3）計算指標權重系數(shù)ωj［11］，公式為ωj ＝（1－ sj）／

2.4.3 組合權重確定 以各評價指標主觀權重為ω1，客觀權重為ω2，計算組合權重ωj［7］，公式為ωj ＝，結合主客觀賦權，得到組合權重值ω和綜合評分Pj，公式為Pj＝ωa（100ωjxj）／ωjmax，再進行直觀分析、方差分析［7］，結果見表1。

表1 各評價指標權重值

2.5 星點設計?響應面法 以加水量（A）、煎煮時間（B）為影響因素，羥基紅花黃色素A、沒食子酸、沉香四醇、異補骨脂苷、馬錢苷、補骨脂苷、特女貞苷含量及浸膏得率為評價指標，計算綜合評分（Y），因素水平見表2，結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

采用Design?Expert 8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進行多元線性回歸，得方程為Y＝94.58＋3.2A－0.062B＋0.75AB－1.20A2－2.03B2（r＝0.92、P＝0.007 6），可知該模型擬合度較好，誤差較小，可用于預測，方差分析見表4，可知各因素影響程度依次為A＞B，其中A有顯著影響（P＜0.01）。響應面分析見圖1，最終確定最優(yōu)工藝為加水量14倍，煎煮時間80 min，綜合評分96.51 分。

圖1 各因素響應面圖

表4 方差分析

2.6 提取次數(shù)篩選 取處方量藥材，在“2.3”項優(yōu)化工藝下分別提取1、2、3次，計算綜合評分，結果見表5。由此可知，提取2 次時綜合評分已達到提取3 次時的94%，故從節(jié)約資源、本等角度考慮，最終確定提取次數(shù)為2 次。

表5 提取次數(shù)篩選結果

2.7 驗證試驗 按照優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗［12］，結果見表6，可知該工藝合理可行，預測性、重復性均好。

表6 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論與結論

前期單因素試驗結果表明，煎煮時間對鹿紅方顆粒中各成分含量影響顯著，為保證其提取，在工藝優(yōu)化前將各藥材均浸泡45 min。本實驗在預試驗、單因素試驗基礎上選擇兩因素三水平，即加水量10、12、14倍，煎煮時間0.5、1、2 h，而煎煮次數(shù)為非連續(xù)變量，與其他連續(xù)性變量之間存在一定的交互作用，故需單獨考察。

常用的試驗設計方法有均勻設計、正交試驗設計等，但均存在模型預測性差、精度不夠等缺點，并且取值往往只接近最佳值，而無法精確到最佳點，不能靈敏地對各因素之間的交互作用進行考察［13］。星點設計作為響應面法的一種設計方式，在遵循其基本原理［14］的同時適合考察指標與影響因素之間的非線性關系。本實驗所采用的星點設計?響應面法可進行非線性的擬合，從而得到擬合度較高的最佳模型，并且具有精度高、試驗次數(shù)少等特點，在藥學領域中廣泛應用［15］。

本實驗選擇羥基紅花黃色素A、沒食子酸、沉香四醇、馬錢苷、異補骨脂苷、補骨脂苷、特女貞苷作為指標成分，其中羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、特女貞苷與2020 年版《中國藥典》相關標準一致，在四者轉移到水煎液中的同時可對量質傳遞過程進行監(jiān)控。另外，還對紅景天苷、淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素進行指認，但其含量在水煎液中較低，對工藝無明顯影響，故未納入評價指標。

綜上所述，本實驗采用星點設計?響應面法結合G1?熵權法優(yōu)化鹿紅方顆粒提取工藝，其穩(wěn)定可控，有效成分得率較高，可為該制劑工業(yè)化生產提供實驗依據(jù)。