張 玲孫媛 高春華 隋海娟 于海英 楊育紅?

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 錦州121001； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 遼寧 錦州121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 錦州121001； 4.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 遼寧 錦州121001）

膿毒癥是一種由感染導(dǎo)致的宿主反應(yīng)失調(diào)，可引起危及生命的器官功能障礙的全身炎癥反應(yīng)綜合征［1］，約50%膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌損傷。膿毒癥心肌病作為膿毒癥的常見并發(fā)癥，可使患者死亡率達(dá)80%左右［2?3］。積極探索膿毒癥心肌病的有效治療方案是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。紅芪多糖作為紅芪的主要活性成分，是從紅芪干燥根中提取的多糖?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等作用［4?6］，具有保護(hù)糖尿病心肌病小鼠和急性心肌梗死大鼠心肌損傷的作用［7?8］，但對(duì)膿毒癥心肌病是否存在影響未見報(bào)道。本研究運(yùn)用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立小鼠膿毒癥心肌病模型，探討紅芪多糖對(duì)模型小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及對(duì)TLR4 信號(hào)通路的影響，以期為膿毒癥心肌病的治療提供理論參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 50 只雄性C57BL／6N 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021?0006。所有小鼠飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（21±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（遼）2019?0007。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求（審查號(hào)2020041）。

1.2 試劑與藥物 紅芪多糖（純度90%），甘肅益生祥生物技術(shù)有限公司，用時(shí)以生理鹽水稀釋。LPS，美國(guó)Sigma 公司；ELISA 試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；TLR4 一抗，美國(guó)Santa Cruz 公司；IκBα、NF?κB 一抗，美國(guó)Cell Signaling公司；β?actin，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 ACUSON 彩色多普勒超聲診斷儀，德國(guó)Siemens 公司；iMark 酶標(biāo)檢測(cè)儀、電泳儀，美國(guó)Bio?Rad公司；BX51 型熒光顯微鏡，日 本Olympus 公司；ChampGel 3000 型凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及造模 參照文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道方法建立膿毒癥心肌病模型，50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、LPS 組及紅芪多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組10 只。紅芪多糖組灌胃相應(yīng)劑量紅芪多糖，空白組和LPS 組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)給藥14 d后，LPS 組和紅芪多糖組均一次性腹腔注射10 mg／kg LPS 建立膿毒癥心肌病小鼠模型，空白組則腹腔注射蒸餾水。

2.2 小鼠心功能檢測(cè) 小鼠腹腔注射LPS 8 h后，用七氟醚對(duì)其進(jìn)行麻醉，超聲診斷儀檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）等指標(biāo)。

2.3 ELISA 法檢測(cè)血清炎癥因子水平 小鼠心功能檢測(cè)完畢后，心臟取血，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，分裝后于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細(xì)胞介素?1β（IL?1β）和白細(xì)胞介素?6（IL?6）水平。

2.4 小鼠心肌組織HE 染色 小鼠取血后，按0.5 mL／100 g 腹腔注射20% 烏拉坦麻醉，開胸取出心臟，剪去心臟周圍多余的組織，在生理鹽水中洗凈并用濾紙吸干水分，一部分于－80 ℃冰箱保存，用于RT?qPCR 和Western blot 檢測(cè)；另一部分于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，浸蠟，包埋，制備4 μm石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，蘇木精染色，鹽酸分化，伊紅染色，乙醇脫水透明，樹脂封片，200 倍顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。

2.5 RT?qPCR 法檢測(cè)心肌組織中TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 表達(dá) 剪取各組小鼠心肌組織，經(jīng)過裂解、抽提、RNA 沉淀和清洗，提取心肌總RNA，用第一鏈cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA（哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司）。從GenBank 中查詢小鼠TLR4、IκBα和NF?κB的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行RT?qPCR反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT法計(jì)算小鼠心肌組織中TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測(cè)TLR4、IκBα、NF?κB 蛋白表達(dá) 取60 mg 凍存的心肌組織，加入胞漿蛋白抽提試劑充分勻漿，按總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制膠，SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉后，加入稀釋的TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p?IκBα）、NF?κB、磷酸化NF?κB（p?NF?κB）和β?actin 一抗，4 ℃雜交孵育過夜，次日洗膜后加二抗25 ℃孵育1 h，ECL 法顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值，以β?actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅芪多糖對(duì)小鼠心功能的影響 由表2 可知，與空白組比較，LPS 組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD 降低了44.09%、60.86%、29.67%、40.47%（P＜0.01），說明造模成功，小鼠心功能受損；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心功能指標(biāo)均升高（P＜0.05，P＜0.01），并與藥物劑量呈正相關(guān)。

表2 各組小鼠心功能比較（，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse cardiac functions of each group（，n＝5）

表2 各組小鼠心功能比較（，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse cardiac functions of each group（，n＝5）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與LPS 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 紅芪多糖對(duì)小鼠心肌形態(tài)的影響 如圖1 所示，空白組小鼠心肌的形態(tài)及排列無異常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙無異常變化；與空白組比較，LPS 組小鼠心肌細(xì)胞呈現(xiàn)異常變形，心肌組織間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌細(xì)胞有空泡狀改變；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)隨藥物劑量增加而逐漸趨向正常，細(xì)胞空泡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，說明紅芪多糖可改善膿毒癥心肌病的病理變化。

圖1 各組小鼠的心肌組織形態(tài)（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of mouse myocardium of each group（HE，×200）

3.3 紅芪多糖對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響如圖2 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖2 各組小鼠血清TNF?α、IL?1、IL?6 水平比較（，n＝5）Fig.2 Comparison of mouse serum TNF?α，IL?1 and IL?6 levels of each group（，n＝5）

3.4 紅芪多糖對(duì)小鼠心肌組織TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠心肌組織TLR4、NF?κBmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌組織TLR4、NF?κBmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性；各組小鼠心肌組織中IκBαmRNA 表達(dá)無明顯差 異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠心肌組織TLR4、 IκBα、 NF?κB mRNA 表達(dá)比較（，n＝3）Fig.3 Comparison of TLR4，IκBα and NF?κB mRNA expressions in mouse myocardial tissue of each group（，n＝3）

3.5 紅芪多糖對(duì)小鼠心肌組織TLR4／IκBα／NF?κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠心肌組織TLR4、p?IκBα／IκBα、p?NF?κB／NF?κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌組織TLR4、p?IκBα／IκBα 和p?NF?κB／NF?κB 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖4 各組小鼠心肌組織TLR4、IκBα、NF?κB 蛋白表達(dá)比較（，n＝3）Fig.4 Comparison of TLR4，IκBα and NF?κB protein expressions in mouse myocardial tissue of each group（，n＝3）

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為膿毒癥的病機(jī)主要為正氣不足、毒熱內(nèi)蘊(yùn)、絡(luò)脈癖滯，氣血失運(yùn)，臟腑失于濡養(yǎng)。心臟便是受累的臟腑之一。雖然很多研究探尋膿毒癥心肌病的發(fā)病機(jī)制［10?12］，但目前該病仍以支持治療為主，尚缺乏針對(duì)性治療藥物。紅芪系豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys的干燥根，2020 年版《中國(guó)藥典》記載紅芪的功能有“補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌”［13］。紅芪多糖作為紅芪的主要活性成分，可通過補(bǔ)氣、益氣使得血脈行、痰濁化、經(jīng)絡(luò)濡養(yǎng)［7］。由上述中醫(yī)理論推測(cè)，紅芪多糖對(duì)膿毒癥心肌病可能存在保護(hù)作用。

臨床研究顯示，膿毒癥心肌病的典型表現(xiàn)是心功能障礙［14］，且心臟結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生病理性改變［15］。借鑒張勝等［16］的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，可通過檢測(cè)心功能和觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)價(jià)該病模型是否成功。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS 組小鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)均較空白組下降，組織切片可見心肌細(xì)胞受損和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，由此可判定膿毒癥心肌病模型制備成功。紅芪多糖干預(yù)后，膿毒癥小鼠心功能指標(biāo)有顯著改善，心肌細(xì)胞受損程度和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，提示紅芪多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)小鼠的膿毒癥心肌病具有保護(hù)作用。

有研究表明TLR4 信號(hào)通路是引起膿毒癥的主要通路［17］。TLR4 是Toll 樣受體家族中重要的成員之一，表達(dá)于心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞等表面，能識(shí)別LPS 和器官損傷后釋放的內(nèi)源性配體［18］。TLR4 被LPS 激活后可使IκBα 磷酸化，作為NF?κB 蛋白的主要抑制劑，IκBα 缺乏或活性改變可導(dǎo)致NF?κB 活性失調(diào)，介導(dǎo)發(fā)生各種感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等［19］。發(fā)生磷酸化的IκBα 降解，進(jìn)而使NF?κB 活化，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，釋放TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎因子，引起一系列膿毒癥的病理結(jié)果，包括血管外滲、組織損傷、多臟器功能衰竭甚至死亡［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)紅芪多糖干預(yù)后，LPS 誘導(dǎo)的小鼠血清炎癥因子水平降低，心肌組織中TLR4、NF?κB mRNA和蛋白表達(dá)降低，p?IκBα／IκBα 比值降低。以上結(jié)果表明，紅芪多糖可通過調(diào)控TLR4／IκBα／NF?κB 信號(hào)通路抑制促炎因子TNF?α、IL?1β 和IL?6 的釋放，改善小鼠心功能，抑制心肌組織的病理改變。

綜上所述，本研究證實(shí)紅芪多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)小鼠的膿毒癥心肌病具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4／IκBα／NF?κB 信號(hào)通路有關(guān)。