王燕萍 賈旭森 牛偉霞王艷崔方 胡芳弟?

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院， 甘肅 蘭州730000； 2.東阿阿膠股份有限公司， 山東 聊城252000）

黨參是一種重要的藥食同源中藥，含多糖、黃酮、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等功效成分及氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分［1］，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津等功效，主要用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善胃腸道功能、提高學(xué)習(xí)和記憶能力等［2?3］。

發(fā)酵可改變中藥材活性成分含量及結(jié)構(gòu)，常被用于其增效減毒方面［4?5］。中藥固體發(fā)酵是以中藥材為發(fā)酵基質(zhì)，利用一種或多種菌種進(jìn)行發(fā)酵的方法［6］，可增加其活性組分含量和活性［7?8］。

酵母菌是典型的糖菌，喜在含糖較高、偏酸性的環(huán)境中生長［9］，而新鮮黨參中富含糖分，可作為其天然營養(yǎng)體系。前期報道，新鮮黨參中多糖、黃酮、黨參炔苷等成分含量均高于加工后藥材［10］；預(yù)實驗表明，在不添加任何營養(yǎng)物質(zhì)和水的情況下，酵母菌可充分利用新鮮黨參中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵并大量繁殖。因此，本實驗采用酵母菌固體發(fā)酵新鮮黨參，并對該工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該藥材的開發(fā)利用提供新方法。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 高效液相色譜，購自美國安捷倫科技公司；UV?1700 紫外分光光度計，購自日本Shimadzu 公司；DHG9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CPA225D 電子分析天平、PH計，購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)，購自廣州賽國生物科技有限公司；IS?RDD3 臺式恒溫振蕩器，購自美國精騏公司；H1650 高速離心機(jī)，購自湖南湘儀科技有限公司；FreeZone?6L 冷凍干燥機(jī)，購自美國Labconco 公司；LS?35LD 滅菌鍋，購自致微（廈門）儀器有限公司；破壁機(jī)，購自浙江蘇泊爾股份有限公司；750T 多功能粉碎機(jī)，購自上海市浦恒信息科技有限公司；25×16 血球計數(shù)板，購自上海市求精生化試劑儀器有限公司；S?433D氨基酸全自動分析儀、LCAK06／Na 磺酸基強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂色譜柱，購自德國Sykam公司；N?WYVAP 112 型氮吹儀，購自美國Organomation 公司；S220?K 型酸度計，購自瑞士Mettler?Toledo 公司。

1.2 試劑與藥物 新鮮黨參采自甘肅省臨洮縣，經(jīng)甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任藥師鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf 的新鮮根。高活性干酵母菌（釀酒酵母屬）Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司。蛋白胨、酵母膏，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂，購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖（批號110833?200302），購自中國食品藥品檢定研究院。蘆丁對照品（批號05?1001），購自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心；氨基酸對照品（包括丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、半胱氨酸Cys、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、組氨酸His、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、賴氨酸Lys、蛋氨酸Met、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val，批號SLBM6769V），購自美國Sigma?Aldrich 公司。茚三酮、色譜純甲醇，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 酵母菌固體發(fā)酵工藝建立

2.1.1 培養(yǎng)基制備 YEPD 固體培養(yǎng)基配方為蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖1%、瓊脂2%，pH自然，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min；YEPD 液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖1%，pH 自然，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

2.1.2 菌種活化 將菌種接種于YEPD 固體培養(yǎng)基中，活化48 h 備用。

2.1.3 液體培養(yǎng)擴(kuò)繁 將活化菌種接種于YEPD液體搖瓶培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速220 r／min條件下培養(yǎng)24 h，使其產(chǎn)生大量菌體，作為液體菌種。

2.1.4 發(fā)酵產(chǎn)物制備 將新鮮黨參用破壁機(jī)多次打碎至無較大顆粒，置于500 mL 錐形瓶中，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，取出，靜置至室溫，接入酵母菌種，置于恒溫恒濕箱中避光發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物置于40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，即得。

2.2 發(fā)酵終點確定 將酵母菌按一定比例接種在滅菌后的新鮮黨參基質(zhì)中進(jìn)行發(fā)酵，在不同時間點取出菌質(zhì)，測定pH值，再取不同時間點發(fā)酵產(chǎn)物，測定浸出物含量。

2.2.1 醇浸出物、水浸出物含量測定 按照2020年版《中國藥典》四部2201 項下熱浸法［11］進(jìn)行測定，其中水為蒸餾水，測定醇浸出物時以稀乙醇替代蒸餾水。

2.2.2 pH 值測定 采用PH 計測定發(fā)酵過程中菌質(zhì)pH 值。

2.3 酵母菌固體發(fā)酵工藝優(yōu)化 文獻(xiàn)［12］ 報道，酵母菌最適生長溫度為30 ℃，新鮮黨參含水量為66.6%，在此基礎(chǔ)上以含水量（A）、溫度（B）、加菌量（B）為影響因素，設(shè)計三因素三水平L9（33）正交試驗，具體見表1。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，新鮮黨參發(fā)酵后指標(biāo)成分黃酮、多糖、黨參炔苷含量分別增加了75.45%、46.35%、44.68%，即黃酮含量變化最明顯，故選擇其作為評價指標(biāo)。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.3.1 黃酮供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當(dāng)于干藥材1.0 g）及1.0 g發(fā)酵黨參粉末，置于具塞三角瓶中，10 倍量甲醇超聲提取3次，每次30 min，濾過，合并濾液，在60 ℃下減壓蒸干，甲醇復(fù)溶并定容至10 mL 量瓶中，即得，每種樣品平行3 份。

2.3.2 含量測定 參考文獻(xiàn)［13］ 報道，將供試品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量。

2.4 發(fā)酵前后微觀結(jié)構(gòu)變化研究 參考文獻(xiàn)［14］報道，采用掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察。

2.5 發(fā)酵前后有效成分含量變化研究

2.5.1 總糖、多糖、低聚糖

2.5.1.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當(dāng)于干藥材1.0 g）及1.0 g發(fā)酵黨參粉末，95%乙醇加熱回流提取2 次進(jìn)行脫脂，每次1 h，濾過，藥渣干燥，加10 倍量水煎煮3次，每次40 min，合并濾液，在70 ℃下減壓濃縮至25 mL，作為總糖供試品溶液。取適量，加95%乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為80%，在4 ℃下靜置24 h后離心，取上清液，置于水浴鍋上蒸干，加水溶解并定容至25 mL 量瓶中，作為低聚糖供試品溶液。將沉淀用水溶解并定容至25 mL 量瓶中，作為多糖供試品溶液。上述溶液均平行制備3 份。

2.5.1.2 含量測定 參考文獻(xiàn)［15］ 報道，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量。

2.5.2 三萜

2.5.2.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當(dāng)于干藥材1.0 g）及1.0 g發(fā)酵黨參粉末，置于250 mL 具塞三角瓶中，加100 mL 95%乙醇超聲提取3次，每次30 min，濾過，合并濾液，在60 ℃下減壓濃縮至干，30 mL氯仿溶解，飽和NaHCO3溶液萃取3次，將NaHCO3層用6 mol／L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至3～4，最后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，在60 ℃下減壓蒸干，用無水乙醇溶解并定容至50 mL 量瓶中，即得。

2.5.2.2 含量測定 參考文獻(xiàn)［16］ 報道，將供試品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量。

2.5.3 黨參炔苷

2.5.3.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當(dāng)于干藥材1.0 g）及1.0 g發(fā)酵黨參粉末，加10 倍量甲醇回流提取3次，每次40 min，濾過，濾液濃縮后定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.5.3.2 含量測定 參考文獻(xiàn)［13］ 報道，將供試品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用HPLC 法測定。

2.5.3.3 色譜條件參考文獻(xiàn) ［13］ 報道，DiamonsiL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（26∶74）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長267 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.4 氨基酸

2.5.4.1 供試品溶液制備 精密稱取適量新鮮黨參（相當(dāng)于干藥材0.5 g）、滅菌黨參（相當(dāng)于干藥材1.0 g）及1.0 g 發(fā)酵黨參粉末，置于水解管中，加入6 mol／L 鹽酸10 mL，再加入1%苯酚溶液3滴，將水解管置于－20 ℃冰箱中冷凍5 min 后通氮氣封口，置于110 ℃烘箱中水解22 h，取出放冷至室溫，打開水解管，水解液過濾后吸取0.5 mL至10 mL EP 管內(nèi)，氮氣吹干，殘留物用6 mL稀釋液溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.5.4.2 含量測定 參考文獻(xiàn)［17］ 報道，采用HPLC 法測定。

2.5.4.3 色譜條件 LCAK 06／Na 型磺酸基強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相緩沖液A、緩沖液B、再生液C；衍生化試劑茚三酮；體積流量A 泵（洗脫泵）0.45 mL／min，M 泵（衍生泵）0.25 mL／min；檢測波長440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸）；進(jìn)樣量50 μL。

2.6 發(fā)酵前后抗氧化活性變化研究

2.6.1 供試品溶液制備 取 “2.5.1.1”項下95%乙醇提取物，在60 ℃下減壓濃縮至25 mL，即得。

2.6.2 清除率測定

2.6.2.1 DPPH 自由基 參考文獻(xiàn)［18］ 報道，取稀釋5 倍后的供試品溶液、80 μg／mL DPPH 溶液各1 mL，搖勻，避光反應(yīng)30 min，以蒸餾水為空白調(diào)零，在517 nm 波長處測定吸光度A1；以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復(fù)3次，取平均值。

2.6.2.2 超氧陰離子自由基 參考文獻(xiàn)［19］報道，取供試品溶液1 mL，加 入 Tris?HCl 緩沖液（16 mmol／L，pH 8.0）、NADH?2Na（338 mmol／L）、PMS（30 mmol／L）、NBT（72 mmol／L）各1 mL，混勻后室溫反應(yīng)5 min，以蒸餾水為空白調(diào)零，在560 nm 波長處測定吸光度A1，以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復(fù)3次，取平均值。

2.6.2.3 羥自由基 參考文獻(xiàn)［20?21］ 報道，取供試品溶液0.2 mL，依次加入反應(yīng)液（20 mmol／L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液、2.67 mmol／L 脫氧核糖、100 mmol／L EDTA）0.6 mL 及0.4 mmol／L 硫酸亞鐵胺溶液、10 mmol／L 過氧化氫溶液各0.2 mL，37 ℃水浴加熱15 min，再加入1% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液、2% 三氯乙酸（TCA）溶液各1 mL終止反應(yīng)，沸水浴加熱15 mim 后冷卻至室溫，以蒸餾水為空白調(diào)零，在532 nm 波長處測定吸光度A1；以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復(fù)3次，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)酵終點確定 發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒精，對酵母菌有毒害作用，酵母菌呼吸產(chǎn)物積累使pH 值發(fā)生改變而不再適宜其生長，故pH 值可作為判斷發(fā)酵終點的指標(biāo)。由圖1 可知，pH 值在48 h 后趨于穩(wěn)定，可認(rèn)為發(fā)酵達(dá)到終點。

圖1 不同發(fā)酵時間pH 值變化Fig.1 pH value changes at different fermentation time

另外，酵母菌呼吸時會消耗營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致后者不足，很難維持前者代謝需求，從而使反應(yīng)速率降低或停止，故水浸出物、醇浸出物含量也可作為判斷發(fā)酵終點的指標(biāo)。由圖2 可知，醇浸出物、水浸出物含量在48 h 后趨于穩(wěn)定，故確定發(fā)酵時間為48 h。

圖2 不同發(fā)酵時間醇浸出物（A）、水浸出物（B）含量變化Fig.2 Content changes of alcohol extract（A）and water extract（B）at different fermentation time

3.2 酵母菌固體發(fā)酵工藝優(yōu)化 表2 顯示，各因素影響程度依次為B（溫度）＞C（加菌量）＞A（含水量）。方差分析見表3，可知因素B有顯著影響（P＜0.05），而A、C無顯著影響（P＞0.05），綜合考慮工藝的操作性及成本，最終確定最優(yōu)工藝為A1B2C2，即發(fā)酵溫度30 ℃，含水量66%，加菌量10%。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests（n＝3）

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

按照上述優(yōu)化工藝制備3 批樣品，測得黃酮含量分別為1.23%、1.22%、1.18%，平均值為1.21%，RSD 為2.19%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3 發(fā)酵前后微觀結(jié)構(gòu)變化 圖3 顯示，發(fā)酵可使新鮮黨參的致密組織變成了疏松多孔的結(jié)構(gòu)。

圖3 各樣品SEM 圖Fig.3 SEM images of various samples

3.4 發(fā)酵前后有效成分含量變化 表4 顯示，與新鮮黨參比較，發(fā)酵黨參中低聚糖、總糖含量分別降低7.56%、35.95%，前者含量降低的原因是酵母菌以其為糖源進(jìn)行生長代謝活動，進(jìn)而使后者含量降低；黃酮、多糖、三萜、黨參炔苷、總氨基酸含量分別升高70.27%、47.92%、128.00%、41.38%、69.90%；除了胱氨酸外，其余16 種氨基酸含量均升高，其中12 種增加率在60%以上，同時藥用氨基酸（Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys）、人體必需氨基酸（Thr、Val、Met、Phe、Lys、Ile、Leu）含量分別升高66.39%、74.16%。

表4 發(fā)酵前后有效成分含量變化（n＝3）Tab.4 Content changes of effective constituents before and after fermentation（n＝3）

3.5 發(fā)酵前后抗氧化活性變化 圖4 顯示，發(fā)酵后DPPH、超氧陰離子、羥自由基清除活性均加強(qiáng)，其原因一方面為有效成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，具有較強(qiáng)的抗氧化活性；另一方面，在發(fā)酵過程中酵母菌通過自身生長代謝產(chǎn)生一些活性物質(zhì)，可能使其抗氧化活性增加。

圖4 發(fā)酵前后對超氧陰離子自由基（A）、DPPH 自由基（B）、羥自由基（C）清除率變化Fig.4 Scavenging rate changes on superoxide anion free radical（A），DPPH free radical（B）and hydroxyl free radical（C）before and after fermentation

4 討論

本實驗首先通過發(fā)酵前后水浸出物、醇浸出物含量及發(fā)酵過程中pH 值確定發(fā)酵終點，發(fā)現(xiàn)三者在48 h 后趨于穩(wěn)定，表明已達(dá)到了發(fā)酵終點。再以黃酮含量為指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平正交試驗對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定為溫度30 ℃，含水量66%，加菌量10%。最后考察了有效成分含量及自由基清除活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后黨參黃酮、多糖、三萜、黨參炔苷、總氨基酸含量分別升高了70.27%、47.92%、128.00%、41.38%、69.90%，而總糖、低聚糖含量分別降低了7.56%、35.95%；發(fā)酵產(chǎn)物95%乙醇提取物對DPPH、超氧陰離子、羥自由基的清除活性較高。新鮮黨參通過酵母菌發(fā)酵后，多糖含量增加，總糖、低聚糖含量降低，可為開發(fā)適用于糖尿病患者的特醫(yī)食品提供一定思路。