莫小群，王 雅，陳顯玲*，農(nóng)秀麗，盧麗婷，楊福川，蘇 龍,2

（1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來(lái)賓 546199；2.廣西糖資源工程技術(shù)研究中心，廣西來(lái)賓 546199）

香蕉是一種重要的熱帶、亞熱帶水果，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[1]。廣西作為我國(guó)香蕉的主產(chǎn)區(qū)，2020 年香蕉產(chǎn)量達(dá)337.61 萬(wàn)t，居全國(guó)第2 位[2]。香蕉質(zhì)地柔軟，主要以鮮食為主，可常年供應(yīng)，但市場(chǎng)價(jià)格波動(dòng)大、容易腐爛，嚴(yán)重打擊了農(nóng)民種植香蕉的積極性。隨著香蕉產(chǎn)量的逐年增加，鮮食過(guò)剩的狀況越來(lái)越嚴(yán)重，因此，香蕉的深加工是香蕉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必由之路。香蕉的深加工產(chǎn)品主要有香蕉片[3-4]、香蕉粉[5]、香蕉酒[6-7]、香蕉醋[8]、香蕉飲料[9]、香蕉酸奶[10]、香蕉面膜[11]等。目前香蕉益生菌發(fā)酵飲料主要以益生菌乳飲料為主，關(guān)于香蕉益生菌發(fā)酵非乳飲料的相關(guān)報(bào)道較少，主要是針對(duì)成品香蕉乳酸飲料口感等問(wèn)題進(jìn)行研究改進(jìn)[12-14]，沒(méi)有涉及益生菌飲料中γ-氨基丁酸含量和活菌數(shù)的優(yōu)化問(wèn)題。

γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA），化學(xué)名為4-氨基丁酸，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)。植物如豆屬、中草藥等的種子、根莖和組織液中都含有γ-氨基丁酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的氨基酸[15]。γ-氨基丁酸屬?gòu)?qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸，具有降血壓[16]、預(yù)防糖尿病[17]、免疫調(diào)節(jié)[18]、減緩癲癇病[19]、增強(qiáng)腦活力[20]、改善肝腎功能[21-22]等功效。目前，GABA 的制備主要以微生物發(fā)酵法為主，包括植物乳桿 菌（Lactobacillus plantarum）[23]、發(fā) 酵 乳 桿 菌（L.fermentum）[24]、對(duì)雙歧桿菌（Bifidobacterium）[25]、副干酪乳桿菌（L.paracasei）[26]等。林楊等[27]利用戊糖乳桿菌為發(fā)酵菌株，通過(guò)條件的優(yōu)化得到一款GABA 含量為1.98 g/L的乳酸菌飲品。韓嘯[28]以短乳桿菌DL1-11 為出發(fā)菌株，通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到一種GABA 含量是優(yōu)化前2.37 倍的功能性發(fā)酵乳。目前，對(duì)富含GABA 的香蕉非乳發(fā)酵飲料相關(guān)研究較少。

本試驗(yàn)以廣西本地的香蕉為材料制作非乳益生菌香蕉發(fā)酵飲料，以飲料中GABA 含量和活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行工藝條件的優(yōu)化，旨在豐富香蕉深加工產(chǎn)品類(lèi)型，為香蕉產(chǎn)業(yè)精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉為市售廣西‘浦北矮香蕉’；植物乳桿菌（L.plantarum）GDMCC 1.1516、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）GDMCC 1.1796、短乳桿菌（L.breris）GDMCC 1.1800、干酪乳桿菌（L.casei）GDMCC 1.80，廣東省微生物菌種保藏中心；保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）CCTCC CB 20082294，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；果膠酶（30 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；一級(jí)白砂糖，廣西來(lái)賓湘桂糖業(yè)有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；L-谷氨酸鈉（食品級(jí)），河北百味生物科技有限公司。

硼酸、苯酚、次氯酸鈉、無(wú)水乙醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

UV1050 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；HH-s 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3E pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZSD-1090 型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；A11EC 多功能打漿機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉發(fā)酵飲料工藝流程

參考蘇龍等[29]的工藝進(jìn)行改進(jìn)。新鮮香蕉→挑選→去皮、切塊→打漿→護(hù)色→酶解→離心→成分調(diào)整→滅菌、冷卻→接種發(fā)酵→成品。

1.2.2 工藝操作要點(diǎn)

（1）選材、打漿、護(hù)色

挑選無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮香蕉，剝皮切成5 cm 長(zhǎng)的塊狀，以香蕉和純凈水的質(zhì)量比為1∶5（g/g）混合，放入打漿機(jī)中打漿，再加入0.08%維生素C 進(jìn)行護(hù)色。

（2）酶解

加入0.3%果膠酶，調(diào)整pH 至5.0，于50 ℃水浴5 h，之后在10 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液，即得香蕉汁。

（3）成分調(diào)整

在酶解后的香蕉果汁中加入白砂糖攪拌，待白砂糖完全溶解后，用糖度計(jì)對(duì)總糖度進(jìn)行調(diào)整，使香蕉汁總糖度為10%；加入碳酸氫鈉或檸檬酸調(diào)pH 至6.5。

（4）滅菌、冷卻

調(diào)整好的香蕉汁于89 ℃殺菌15 min，冷卻后于4 ℃條件下密封貯藏，備用。

（5）發(fā)酵

菌株活化：將植物乳桿菌和短乳桿菌菌株接種至10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于35 ℃下培養(yǎng)24 h，按接種量10%（V/V）接種至100 mLMRS 液體培養(yǎng)基中，于35 ℃下培養(yǎng)24 h，備用。

接種發(fā)酵：取活化好的植物乳桿菌和短乳桿菌，活菌數(shù)均為7.0 lg(CFU/mL)，按體積比為1∶1，接種至殺菌冷卻后的香蕉汁中，置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，即得成品。

1.2.3 菌種的篩選

將植物乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌，活菌數(shù)均為7.0 lg(CFU/mL)，按體積比為1∶1、接種量為3%分別接入調(diào)配好且滅菌的香蕉汁中，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，檢測(cè)GABA 含量和活菌數(shù)，篩選較優(yōu)菌種[30]。

1.2.4 菌種比例的篩選

選擇植物乳桿菌和短乳桿菌，活菌數(shù)均為7.0 lg(CFU/mL)，植物乳桿菌∶短乳桿菌體積比設(shè)置為0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、2∶1，進(jìn)行不同比例菌種發(fā)酵試驗(yàn)，接種量為3%，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，檢測(cè)GABA的含量和活菌數(shù)，篩選發(fā)酵菌種最優(yōu)比例[30]。

1.2.5 香蕉飲料發(fā)酵單因素試驗(yàn)

以GABA 含量和活菌數(shù)為檢測(cè)指標(biāo)，考察L-谷氨酸鈉濃度（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）、接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵時(shí)間（16、20、24、28、32 h）和發(fā)酵溫度（33、35、37、39、41 ℃）4 個(gè)因素對(duì)香蕉飲料發(fā)酵的影響[30]。其中發(fā)酵的初始條件為發(fā)酵溫度35 ℃、接菌量3%、發(fā)酵時(shí)間24 h。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以GABA 產(chǎn)量和活菌數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，對(duì)接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 香蕉發(fā)酵飲料響應(yīng)面因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface design of the banana beverage

1.2.7 GABA 含量的檢測(cè)方法

γ-氨基丁酸含量的測(cè)定參考上官文菲等[31]的方法。取發(fā)酵樣品1 mL，加入1 mol/L 的NaCO3溶液0.1 mL，pH值10.0、0.2 mol/L 的硼酸鹽緩沖液0.5 mL，6%苯酚1 mL，混勻后室溫下在5 min 內(nèi)加入5.2%NaClO 溶液1.0 mL，混勻，放置5～8 min。沸水浴10 min 后立刻冰水浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液2.0 mL，混勻后在冰水浴中放置30 min。以空白試劑為參比，在波長(zhǎng)640 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中GABA 含量。

1.2.8 活菌數(shù)的檢測(cè)方法

活菌數(shù)的檢測(cè)參考國(guó)標(biāo)GB 4789.35—2016 進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

作圖和數(shù)據(jù)處理采用Orgin 8.5 軟件，響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種選擇

由圖1 可知，接種發(fā)酵24 h 后，單一菌種發(fā)酵產(chǎn)GABA 的能力由強(qiáng)到弱的排序?yàn)槎倘闂U菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌?；罹鷶?shù)由多至少的排序?yàn)橹参锶闂U菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌。從產(chǎn)GABA 能力和活菌數(shù)來(lái)看，短乳桿菌和植物乳桿菌能力比其它菌株要強(qiáng)，故選用植物乳桿菌和短乳桿菌混合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

圖1 不同菌種對(duì)GABA 含量和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of different strains on GABA content and viable counts

2.2 菌種比例選擇

由圖2 可知，植物乳桿菌∶短乳桿菌比例為2∶1 或1∶2 混合發(fā)酵24 h 與單一菌種發(fā)酵相比，GABA 產(chǎn)量有所提高，活菌數(shù)沒(méi)有明顯增加。但植物乳桿菌和短乳桿菌比例為1∶1 時(shí)，GABA 產(chǎn)量有明顯的增加，活菌數(shù)也比單一菌種發(fā)酵多；可能是由于植物乳桿菌和短乳桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中互相影響，共同促進(jìn)發(fā)酵的進(jìn)行，這與楊天予等[30]和康三江等[32]的研究結(jié)果相似。因此，選擇植物乳桿菌和短乳桿菌比例為1∶1 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 菌種比例對(duì)GABA 含量和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of strain ratio on GABA content and viable counts

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1L-谷氨酸鈉濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖3 可知，隨著底物L(fēng)-谷氨酸鈉濃度的增加，GABA 的含量快速增加，在底物L(fēng)-谷氨酸鈉濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，GABA 的含量達(dá)到最大值，為0.583 mg/mL；當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，GABA 的含量不再增加，分析其原因可能是因?yàn)榇藭r(shí)的菌體已達(dá)到最大GABA 轉(zhuǎn)化率。故選擇2.5 mg/mL 的L-谷氨酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基底物添加量。從結(jié)果可知，底物濃度對(duì)GABA 含量的影響不大，故不作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化的因素。

圖3 L-谷氨酸鈉濃度對(duì)GABA 含量的影響Fig.3 Effects of sodium hydrogen glutamate concentration on GABA content

2.3.2 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖4 可知，隨著接種量的增加，GABA 含量和活菌數(shù)不斷增加；當(dāng)接種量為4%時(shí)，GABA 含量和活菌數(shù)達(dá)到最大值，隨著接種量的繼續(xù)增加，GABA 含量和活菌數(shù)都呈下降趨勢(shì)。這是由于接種量增加，發(fā)酵前期菌株快速生長(zhǎng)繁殖，營(yíng)養(yǎng)成分消耗過(guò)快，發(fā)酵代謝產(chǎn)物GABA 和乳酸含量也相應(yīng)增加，發(fā)酵液pH 降低，導(dǎo)致發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)成分匱乏，菌體生長(zhǎng)代謝被抑制。故選擇接種量為4%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)GABA 含量和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of inoculum size on GABA content and viable counts

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)菌種保藏機(jī)構(gòu)推薦，植物乳桿菌和短乳桿菌最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，設(shè)計(jì)混合菌種發(fā)酵溫度優(yōu)化。由圖5（見(jiàn)上頁(yè)）可知，在33～41 ℃之間，GABA 含量和活菌數(shù)均呈先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為39 ℃時(shí)，GABA 含量和活菌數(shù)均達(dá)到最大值，分別為0.559 mg/mL 和6.743 lg(CFU/mL)，說(shuō)明39 ℃對(duì)混合菌種菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的分泌是最合適的，故選擇發(fā)酵溫度39 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)GABA 含量和活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on GABA content and viable counts

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的分泌極為重要。由圖6 可知，發(fā)酵時(shí)間在16～24 h 范圍內(nèi)，GABA 含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增加，24～32 h 內(nèi)，GABA 含量增加幅度緩慢。在16～24 h 內(nèi)，活菌數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而直線上升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值；隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，發(fā)酵液pH 下降，菌體可能會(huì)自溶，故活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。綜合考慮活菌數(shù)和GABA 含量，發(fā)酵時(shí)間選擇24 h。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA 含量和活菌數(shù)的影響Fig.6 Effects of fermentation time on GABA content and viable counts

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 回歸方程

實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

對(duì)表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，分別得到自變量與GABA 含量（Y1）和活菌數(shù)（Y2）的二次多項(xiàng)回歸方程為Y1=0.69+0.063A-0.024B+0.028C+2.5×10-4AB+0.015AC-0.030BC-0.031A2 -0.025B2-0.034C2。Y2=9.52+0.22A-0.28B-0.54C-0.44AB-0.021AC-0.69BC-0.82A2-0.83B2+0.04C2。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示，該回歸模型P1＜0.000 1、P2=0.000 2，方程模型達(dá)到極顯著，失擬項(xiàng)P1=0.220 1＞0.05、P2=0.066 7＞0.05，差異不顯著；該回歸模型的總決定系數(shù)=0.982 4=0.968 0；調(diào)整決定系數(shù)變異系數(shù)CV1=1.92、CV2=2.82；以上參數(shù)均說(shuō)明該模型擬合程度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對(duì)香蕉飲料發(fā)酵條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

2.4.2 響應(yīng)面分析

由表3 可知，影響GABA 含量的因素按主次順序排列：接種量（A）＞時(shí)間（C）＞溫度（B），其中模型一次項(xiàng)接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）極顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2均處于極顯著水平；交互項(xiàng)BC 極顯著，AB、AC均不顯著。影響活菌數(shù)的因素按主次順序排列：時(shí)間（C）＞溫度（B）＞接種量（A），其中模型一次項(xiàng)發(fā)酵時(shí)間（C）極顯著，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）顯著；二次項(xiàng)A2、B2均處于極顯著水平，C2不顯著；交互項(xiàng)AB、BC 極顯著，AC不顯著。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 Trial 優(yōu)化，通過(guò)對(duì)回歸模型求解方程得出香蕉飲料發(fā)酵的最佳條件為接種量4.62%，發(fā)酵溫度35.33 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，在此條件下香蕉飲料的GABA 含量和活菌數(shù)預(yù)測(cè)值分別為0.746 mg/mL 和9.282 lg(CFU/mL)。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在回歸模型求解方程的基礎(chǔ)上，考慮實(shí)際操作的可行性，修正得出香蕉飲料發(fā)酵的最佳條件為接種量5%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，所得香蕉飲料中GABA 含量均值為0.783 mg/mL，活菌數(shù)均值為10.146 lg(CFU/mL)，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為4.96%和9.30%，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)香蕉飲料發(fā)酵的影響。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵型非乳益生菌香蕉飲料的條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了發(fā)酵型非乳益生菌香蕉飲料的最佳工藝條件為植物乳桿菌∶短乳桿菌=1∶1（按體積比），活菌數(shù)均為7.0 lg(CFU/mL)，接種量5%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，L-谷氨酸鈉添加量2.5 mg/mL。此條件下香蕉飲料的GABA 含量和活菌數(shù)均達(dá)到較高值，GABA 含量為0.783 mg/mL，活菌數(shù)均值為10.146 lg(CFU/mL)，大于T/CNFIA 131—2021 標(biāo)準(zhǔn)中活菌數(shù)的要求，成品飲料具有一定的香蕉氣味和滋味，無(wú)雜質(zhì)。但本文以GABA 含量和活菌數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行工藝優(yōu)化，對(duì)飲料的口感沒(méi)有充分考慮，導(dǎo)致發(fā)酵出來(lái)的香蕉飲料在口感上有所欠缺，如飲料香蕉香味不夠、顏色偏暗、酸味稍重，可能的原因是香蕉飲料在發(fā)酵過(guò)程中香蕉香氣分解，護(hù)色不夠，產(chǎn)生的乳酸偏多。下一步的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃以口感結(jié)合GABA 含量和活菌數(shù)對(duì)發(fā)酵型非乳香蕉飲料進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，以期獲得口感合適、GABA 含量和活菌數(shù)量滿足要求的新型香蕉發(fā)酵飲料，為廣西香蕉深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持。