李文靜，王創(chuàng)

1.武漢市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，武漢 430012；2.華中農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院/微量元素研究中心，武漢 430070

氮素是植物需求量最大的礦質元素，也是植物生長發(fā)育的主要限制因子之一，對提高作物產(chǎn)量起著至關重要的作用。為滿足日益增長的糧食需求，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中往往施用大量氮肥來提高作物產(chǎn)量[1］。然而作物對氮肥的利用效率比較低，研究指出作物只能利用30%~50%所施用的氮肥，這種高肥低效現(xiàn)象會使大量的氮肥流失到環(huán)境中引起一系列環(huán)境問題，如土壤酸化和水體富營養(yǎng)化以及溫室效應加劇等，同時也會增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1-3］。我國是世界最大的氮肥生產(chǎn)和使用國[4］，面對日益增加的糧食需求和氮素肥料過量施用造成的嚴重環(huán)境問題，如何能夠在降低氮素肥料施用的同時保證農(nóng)作物產(chǎn)量，是推動我國發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展過程中的重要命題，其中提高作物本身的氮素利用效率是關鍵途徑[5］。

植物對氮素的利用包括吸收、轉運、同化和再利用等過程。植物吸收和利用的氮素分為有機氮和無機氮，其中無機氮是主要吸收形式，包括硝態(tài)氮和銨態(tài)氮[6］。植物吸收無機氮后，需要進行同化合成氨基酸供各項生命活動所用，其中硝態(tài)氮通過硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite re?ductase，NiR）還原成銨態(tài)氮，銨態(tài)氮再進一步通過谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）構成的GS/GO?GAT 途徑來合成谷氨酰胺和谷氨酸，進而再合成其他含氮化合物（圖1）。由此可見，銨態(tài)氮在植物氮素利用過程中發(fā)揮著十分重要的作用[7］。然而植物需要精細地維持其細胞內銨態(tài)氮的濃度，當銨態(tài)氮過量存在時會對植物產(chǎn)生毒性，使其生長受阻甚至死亡[8-9］。本文總結了近年來植物耐受銨離子毒性機制的研究進展，以期為提高植物耐受銨離子毒性和氮素利用效率提供理論基礎。

1 植物細胞內銨態(tài)氮的主要來源

1.1 根系從土壤中吸收銨態(tài)氮

植物根系從土壤中吸收的銨態(tài)氮來源主要包括微生物固氮生產(chǎn)的銨（如根瘤菌固氮）、土壤有機氮礦化產(chǎn)生的銨和農(nóng)田施用銨態(tài)氮肥等[10-11］。依植物種類和生長習性不同，植物表現(xiàn)出不同的銨離子偏好性和耐受能力。在酸性、通氣性較差和低溫的土壤中，氨化作用強于硝化作用，土壤中無機氮以銨態(tài)氮為主，如長期淹水的稻田。適應這種環(huán)境生長的作物，也往往是偏好吸收銨態(tài)氮的作物，能耐受較高濃度銨離子[12-13］，相反，通氣性良好的旱地土壤中，硝化作用較強，土壤中無機氮以硝態(tài)氮為主，適應旱地生長的作物如馬鈴薯和甜菜等，往往對銨離子較敏感，在高銨條件下容易產(chǎn)生銨毒害[8-9］。植物根系對銨離子的吸收包括高親和和低親和兩種轉運系統(tǒng)，分別在銨離子濃度較低和較高時發(fā)揮作用，包括細胞質膜定位的銨離子轉運蛋白、部分水孔蛋白以及鉀離子通道等[14-18］。以模式植物擬南芥為例，定位于細胞膜上的銨離子轉運蛋白AMT（ammonium transporter，AMT）家族組成其高親和銨離子轉運系統(tǒng)。擬南芥中共有6 個AMT 家族成員（AtAMT1；1~1；5 和AtAMT2；1），它們在銨離子的吸收轉運上發(fā)揮著不同的作用[18］。如定位于根毛和根表皮的AtAMT1；1 和AtAMT1；3 蛋白，對銨離子親和能力強，可直接吸收土壤中的銨離子，而定位于植物根系皮層和內皮層的AtAMT1；2 蛋白，可進一步將質外體內的銨離子進行回收[18］。相比根系，植物地上部分對銨離子的耐受能力往往較差，因此，通過根系吸收進來的銨離子大部分會通過GS/GOGAT 途徑進行同化，很少運輸?shù)降厣喜糠帧Ｈ欢斖饨玟@離子濃度較高時，也會有少部分銨離子通過木質部運輸?shù)街参锏牡厣喜糠?，研究指出定位于根系中柱鞘的AtAMT2；1 參與此過程[19-20］。目前，參與植物地上部銨態(tài)氮分配和再轉運的轉運體蛋白鮮有報道[21］。

1.2 植物內部代謝產(chǎn)生的銨態(tài)氮

1）植物通過硝態(tài)氮還原產(chǎn)生銨態(tài)氮。依據(jù)植物種類不同，吸收的硝態(tài)氮可在根中或者地上部分進行同化[22］。硝態(tài)氮的同化首先需要通過位于細胞質中的硝酸還原酶（NR）還原成亞硝酸根。植物中硝酸還原酶包括2 種類型，最常見的是NADH 特異型，在植物葉片和根系中都有發(fā)現(xiàn)。另一種為NAD（P）H雙特異型，在植物根系中發(fā)揮重要作用[23-24］。亞硝酸根轉運至葉綠體或者質體中，再通過亞硝酸還原酶（NiR）還原成銨態(tài)氮[22］（圖1）。

圖1 植物體內氮素同化途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram of nitrogen assimilation pathways in plants

2）植物通過光合呼吸產(chǎn)生銨態(tài)氮。光合呼吸是植物細胞內代謝產(chǎn)生銨態(tài)氮的重要來源。據(jù)統(tǒng)計，C3植物光合呼吸產(chǎn)生的銨態(tài)氮至少是硝態(tài)氮還原產(chǎn)生銨態(tài)氮的10 倍[25］。光合呼吸包括在葉綠體、過氧化物酶體和線粒體中進行的一系列反應，在葉綠體中產(chǎn)生2-磷酸乙醇酸，然后進入過氧化物酶體中形成甘氨酸，甘氨酸最終進入線粒體中，在轉變?yōu)榻z氨酸過程中釋放出NH3和CO2[26］。

3）植物木質素合成過程中產(chǎn)生銨態(tài)氮。除光合呼吸外，木質素合成途徑也是生成銨態(tài)氮的重要來源之一。在木質素合成途徑中的第一步，苯丙氨酸會在苯丙氨酸解氨酶（PAL）作用下脫氨基形成肉桂酸，同時釋放游離的銨離子[27］。

4）植物衰老過程中氮素活化以及再利用產(chǎn)生銨態(tài)氮。植物進入生殖生長時期，根系活力減弱，從土壤中直接吸收的氮素有限。此時，氮素從衰老組織的再轉運成為氮素的主要來源。氮素的再轉運需要先將衰老組織內的蛋白質進行降解，此過程會釋放出大量氮素包括銨態(tài)氮，這些生成的銨態(tài)氮需要受到嚴格調控以避免對細胞造成毒害[21，28］。

2 植物產(chǎn)生銨離子毒性的原因

雖然銨態(tài)氮是植物生長所需的主要無機氮源之一，但是當其過量存在時會嚴重影響植物的正常生長發(fā)育。植物在高銨脅迫下，會表現(xiàn)出生長受阻，根冠比降低，主根變短而側根增加，地上部葉片失綠和枯萎等癥狀[8，9，29-30］。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中持續(xù)性的施用氮素肥料，土壤中銨態(tài)氮也隨之累積，加上大氣中銨態(tài)氮的沉積，容易使作物，特別是對銨離子不耐受的作物產(chǎn)生毒性，造成減產(chǎn)甚至死亡[31］。目前學術界對銨離子毒害機制有多種解釋，其中銨離子吸收和同化引起的酸化是造成銨毒的主要原因之一。植物根系細胞吸收和同化銨離子的過程會不斷產(chǎn)生并釋放氫離子，引起根際酸化，影響根系對其他養(yǎng)分的吸收，最終影響植物內部生理代謝過程，造成生長脅迫[8，32-34］。當植物在銨態(tài)氮作為唯一氮源的條件下培養(yǎng)時，其外界生長環(huán)境會迅速酸化[35］。研究表明，將水稻幼苗培養(yǎng)在氯化銨作為唯一氮源并且沒有pH 緩沖劑的營養(yǎng)液中，處理2 d 后營養(yǎng)液pH 即從原始的4.5 降至3.5[36］。對于不耐受銨離子的植物，這種外界環(huán)境的酸化會使植物生長受到嚴重脅迫。如模式植物擬南芥，屬于銨態(tài)氮敏感的植物。在高濃度銨離子處理條件下，擬南芥幼苗根系生長明顯受阻，地上部葉片變黃，生物量顯著降低，而當銨離子濃度下降或培養(yǎng)基pH 升高時，幼苗的生長得到顯著恢復，表明外界生長環(huán)境酸化造成的脅迫是產(chǎn)生銨離子毒性的重要原因[37-38］。銨離子吸收和同化產(chǎn)生的氫離子除了通過根系釋放至外界環(huán)境外，還會釋放至質外體中引起質外體酸化。在高銨條件下，植物根系構型會發(fā)生變化，表現(xiàn)為主根生長受阻，側根數(shù)目增加，而這些與高銨引起的質外體酸化有著密切的關系[30，39］。植物除了通過表皮細胞將氫離子直接排至環(huán)境中，根系吸收銨態(tài)氮時還可能將氫離子分泌至內皮層和中柱細胞的質外體中，質外體pH的降低進而刺激生長素的徑向擴散，誘發(fā)側根的生成[30］。同時，這種質外體酸化效應將溶解根系細胞壁中固定的鐵元素，提高細胞壁中鐵元素的有效性，鐵元素在細胞壁中的氧化還原反應誘導活性氧在根尖分生區(qū)過量產(chǎn)生。活性氧積累會誘導胼胝質在根系韌皮部合成，進而抑制了韌皮部蔗糖的運輸與卸載，最終抑制了根系的生長[29，39］。

除根系生長受到銨離子脅迫外，高銨條件下植物地上部也會表現(xiàn)出失綠枯黃等生長脅迫現(xiàn)象。通常情況下植物吸收的銨離子會在根系中同化，而當外界銨離子濃度較高時，會有少部分從根系轉運至地上部[19］，而地上部耐受銨離子較根系差，地上部銨離子濃度的增加也被認為是產(chǎn)生銨離子毒性的原因[40-41］。也有研究指出，植物地上部產(chǎn)生銨離子毒性的原因并非是銨離子本身的過多積累，而與銨離子同化引起的酸化有關[42］。擬南芥GLN2（谷氨酰胺合成酶2）負責在植物地上部將銨態(tài)氮同化為谷氨酰胺，研究發(fā)現(xiàn)，gln2 突變體對銨離子耐受能力增加，在10 mmol/L 銨離子作為氮源生長時，長勢優(yōu)于野生型[42］。為進一步探究突變體耐銨原因，研究者檢測植株地上部銨離子濃度，發(fā)現(xiàn)gln2 突變體耐銨能力增加并不是因為其地上部銨離子濃度降低，相反其地上部銨離子可積累至100 μmol/g，是野生型的近10 倍，而突變體耐受銨離子的真正原因是在于其地上部氫離子濃度相比于野生型顯著降低[42］。研究者指出在高銨條件下，GLN2將銨離子同化成谷氨酰胺的過程中會在細胞質中產(chǎn)生大量氫離子并外排至質外體，而地上部質外體因空間較小無法承受過量氫離子，最終導致細胞內外酸化，擾亂細胞內生理生化代謝過程，通過添加堿性銨溶液降低了野生型植株地上部酸度，使植物銨毒脅迫得到有效緩解[42］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)對酸性敏感的擬南芥突變體植株對銨離子也表現(xiàn)出強烈的敏感性[42］。這些都進一步表明引起植物地上部銨離子毒性的主要原因是銨離子的過多同化釋放大量氫離子引起地上部酸化造成脅迫。綜上所述，酸化是引起植物銨離子脅迫的主要原因之一，其不僅發(fā)生在根系，在植物地上部也同樣存在。與以上理論一致，自然界中對銨離子耐受的植物常常對酸脅迫也較為耐受，如長期生長在淹水環(huán)境的水稻和偏好酸性土壤的園藝作物藍莓，這些現(xiàn)象進一步說明銨毒害與其引起酸化過程密切相關[8，34，43-44］。

除銨離子吸收和同化過程中造成的酸化外，也有學者指出高銨條件下，植物為維持細胞內銨離子穩(wěn)態(tài)，會將過多銨離子泵出至細胞外，形成無效的運輸循環(huán)且消耗大量能量，該過程不利于植物生長，是造成植物銨毒的主要原因[45］。該理論的主要依據(jù)是，在高銨條件下，對銨毒敏感的大麥會將80%吸收的銨離子泵出至細胞外，此過程伴隨著根系呼吸提升40%，耗費大量能量[45］。但是隨后相同的研究組指出細胞內外進行無效循環(huán)的銨態(tài)氮不是銨離子而是氨氣分子，而其運輸過程不消耗能量，這使得銨離子無效循環(huán)引起的能量損耗的說法需要進一步考證[46］。除此之外，在高銨脅迫下植物體內的活性氧會積累，進而誘導一些編碼抗氧化酶的基因上調[35，39，47］，還有一些研究指出高銨處理會打破植物內部激素穩(wěn)態(tài)等[9］，而這些可能是高銨脅迫下的下游反應，并不是造成銨離子毒性的主要原因。

3 植物耐受銨離子的生理及分子機制

近年來，學者們通過篩選銨毒敏感或耐受的突變體以及全基因組關聯(lián)分析等研究，克隆了植物中多個參與銨毒耐受性的關鍵基因，在分子機制層面上對銨毒機制進行了深入研究。植物可通過一些自身的機制來維持對銨離子的耐受性（圖2）。面對高銨脅迫條件，植物進化出對應的保護措施，如高銨濃度下擬南芥主要的銨離子轉運蛋白AMT1；1 會被磷酸化，進而失去功能[48］；同時AMT1；3在高銨條件下會通過內吞作用從細胞膜上被移除[49］，通過抑制At?AMT1；1 和AtAMT1；3 的功能，可顯著降低擬南芥對于銨離子的吸收。然而高銨條件下，銨態(tài)氮仍可以通過一些水孔蛋白、鉀離子通道和非選擇性陽離子通道以自由擴散的方式進入細胞內[14］。

圖2 植物耐受銨離子的分子機制示意圖Fig.2 Schematic diagram of the molecular mechanisms of ammonium tolerance for plants

綜合各種理論，Marino 等[50］提出植物維持細胞質銨離子穩(wěn)態(tài)的3 個核心策略：（1）將銨態(tài)氮存儲在液泡內；（2）將銨態(tài)氮排出細胞外；（3）將銨態(tài)氮進行同化。植物往往聯(lián)合以上3 種策略來共同維持細胞質中的銨離子穩(wěn)態(tài)。植物主要通過GS 同化來消耗銨離子，如光合呼吸產(chǎn)生的銨態(tài)氮會被GS2 同化，木質素合成產(chǎn)生的銨態(tài)氮會被GS1同化[51］，此外，在高銨條件下，編碼GDH 酶的基因也會上調，以消耗銨離子[35］。雖然液泡膜上響應細胞質銨態(tài)氮水平的受體激酶CAP1 被克隆[52］，但銨離子存儲和外排的轉運體蛋白至今未見報道[21，40，53］。

蛋白質的糖基化是蛋白質翻譯后一種常見的修飾，對于蛋白質的正確折疊、轉運和相互作用等十分重要，研究指出蛋白質糖基化缺陷可能是植物受到銨離子脅迫的重要下游反應[54］。GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）是參與合成蛋白質糖基化過程的重要代謝酶，其突變會導致糖基供體GDP-甘露糖合成受阻，進而影響蛋白質糖基化。研究者通過分離編碼GMPase基因的擬南芥突變體，發(fā)現(xiàn)突變體對于銨離子毒性十分敏感，此外銨離子可抑制GMPase活性，GMPase 活性水平控制著植物對銨離子毒性的敏感程度[54］。Tanaka等[55］進一步研究發(fā)現(xiàn)AtNUDX9是一個編碼GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因，參與調控銨離子脅迫下擬南芥的根系生長。轉錄因子At?WRKY46 對銨離子響應十分敏感，尤其在根尖中表達受銨離子強烈誘導，其可直接與AtNUDX9基因的啟動子結合并負調控該基因的轉錄，最終增加蛋白質的糖基化并控制根系伸長區(qū)的銨離子外流，從而正調控高銨條件下的主根生長[56］。

水稻作為喜銨作物，其耐受銨離子的分子機制也得到了學者們的關注。通過研究水稻根系質子泵，研究者發(fā)現(xiàn)在低pH 條件下水稻根系多個編碼H+-ATPase酶的基因會上調表達，通過外排H+來維持細胞質的pH[13，44］。由于在高濃度銨離子供應條件下根際會發(fā)生酸化，質外體H+濃度也會升高，一部分H+會通過擴散作用進入細胞內造成細胞質酸化，水稻通過增強質子泵活性以增強對銨離子的耐受性[13，44］。此外，近期研究表明，超表達水稻一個編碼質子泵的基因OSA1，不僅可以提升水稻對銨離子的吸收和同化，而且可以增加葉片氣孔開度，提升葉片光合效率，最終使水稻產(chǎn)量提升33%，氮素利用效率提升46%，使水稻的碳氮利用效率都得以大幅提升[57］。水稻質子泵的研究或許可以借鑒到其他作物，通過導入銨耐受植物的優(yōu)勢基因，也許能夠提升其他作物對于高銨環(huán)境的耐受能力，對提高產(chǎn)量具有重要意義。

除植物自身的調節(jié)機制外，通過外源措施也能緩解植物銨離子毒性，其中，調節(jié)植物生長環(huán)境的pH能夠有效緩解植物的銨離子毒性，例如硝態(tài)氮的吸收伴隨氫離子同向內流，且硝態(tài)氮還原的過程中可以消耗細胞質內的氫離子，因此，硝態(tài)氮的添加能夠有效緩解銨態(tài)氮帶來的酸化[42，58］。此外鉀離子的添加也是緩解銨離子毒性的有效途徑。研究指出，鉀離子和銨離子有競爭關系，鉀離子的添加可以減少銨離子的吸收[14］。此外，鉀離子還可以提高參與同化銨離子酶的活性，促進銨離子的同化[9，59］。還有研究指出增加根系碳源供應[60］和光照強度等也可緩解銨離子毒性[61-62］。研究還發(fā)現(xiàn)，添加維生素B6也可以緩解銨毒條件下根系的生長抑制[39］。

4 問題與展望

在全球氣候變暖的環(huán)境背景下，二氧化碳的升高會使硝態(tài)氮的還原效率降低，因而未來銨態(tài)氮在農(nóng)業(yè)中的作用越來越重要[63-64］。這種趨勢下，解析植物銨離子耐受機制，挖掘銨離子耐受的優(yōu)異等位基因，培育耐受高銨脅迫的作物尤為重要。雖然目前對植物耐受銨離子毒性的機制有了一定的認識，但是其分子機理和遺傳資源的挖掘還不足，有待進一步的研究。

4.1 銨離子的區(qū)域化分配和組織器官間分配

銨態(tài)氮在細胞內以及各個組織器官間的分配是維持銨態(tài)氮穩(wěn)態(tài)的重要機制，與銨離子耐受機制相比，學術界對于維持植物內部銨離子穩(wěn)態(tài)的轉運平衡機制認識還不清楚。植物將吸收的離子積累在液泡中，通過區(qū)域化分配可減少干擾細胞質中的生化代謝過程[65］，將過多吸收的銨態(tài)氮存貯至液泡內也是緩解銨離子毒性的重要策略[50］。當前報道指出氣態(tài)氨分子可通過TIP 家族蛋白擴散至液泡內[66］，同時CAP1 也被鑒定為定位于液泡上感應細胞質銨態(tài)氮水平的激酶[52］，但是定位于液泡膜上能夠轉運銨離子的轉運蛋白尚未被鑒定[21，53］。鑒于細胞質的pH 為7.0~7.5，細胞質中只有1%的銨態(tài)氮是以氣態(tài)分子形式存在，大部分是離子態(tài)[40］，因此，鑒定液泡膜上的銨離子轉運蛋白十分必要。此外，當前植物內銨態(tài)氮分配機制的研究也不夠深入，相關蛋白鮮有報道[21］，后續(xù)研究應對植物地下部和地上部參與銨態(tài)氮分配的機制進行解析，特別是克隆參與銨態(tài)氮分配和再轉運的關鍵基因，在此基礎上解析這些基因的生理功能和作用機制，可更加清晰地了解銨態(tài)氮在植物亞細胞水平以及組織水平的轉運和分配。

4.2 銨代謝相關酶功能調控

銨態(tài)氮同化為谷氨酰胺的過程是消耗銨態(tài)氮的重要過程，但同時也是產(chǎn)生氫離子的重要途徑[42，67］，后續(xù)研究可對GS1和GS2基因和蛋白在根系和地上部的時空表達和蛋白活性的調控進行研究，以達到對銨態(tài)氮的合理利用同時避免過多氫離子的產(chǎn)生。此外，GDH 酶也是參與銨態(tài)氮穩(wěn)態(tài)的重要酶[68］，可進一步對GDH酶的功能進行挖掘。

4.3 銨毒與耐酸機制

雖然對于銨離子毒性機制的解釋還不統(tǒng)一，但銨態(tài)氮吸收和利用過程中造成的細胞內外的酸化是產(chǎn)生銨離子毒性的重要原因。后續(xù)對于植物耐受銨離子機制的解析可以針對植物的耐酸機制進行研究。例如質子泵是維持細胞內外pH 的重要機制，可對植物中位于細胞膜和液泡膜上的質子泵系統(tǒng)進行分子鑒定和功能挖掘，同時可進一步在作物中篩選耐受銨離子以及耐酸的遺傳材料，通過全基因組關聯(lián)分析等定位優(yōu)勢基因，通過轉基因和基因編輯等技術培育耐受銨離子的作物品種。