賈夏麗， 熊 芬， 熊愛珍,2 *， 楊 莉,2， 王崢濤,2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203)

白蝕丸收錄于2020年版《中國藥典》，由鹽補(bǔ)骨脂、制何首烏、靈芝等14味中藥組成, 是治療白癜風(fēng)的常用藥物。近年來，由白蝕丸導(dǎo)致的不良反應(yīng)甚至肝臟衰竭時(shí)有發(fā)生，國家藥品監(jiān)督管理局在第9期《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》中明確指出白蝕丸可致肝損害，其用藥安全性備受關(guān)注。白蝕丸組方中的制何首烏、補(bǔ)骨脂、黃藥子、紫草均具潛在肝毒性。何首烏中二苯乙烯苷長(zhǎng)期大量使用會(huì)造成肝損傷[1]；大黃素對(duì)人正常肝細(xì)胞具有明顯損傷作用[2]；大黃素甲醚代謝產(chǎn)物可抑制尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)肝毒性[3]；補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素可影響膽汁酸代謝誘導(dǎo)膽汁淤積[4]；黃獨(dú)素B可下調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白2[5]，并引起活性氧的積累誘導(dǎo)線粒體依賴性凋亡[6]；紫草中含多種吡咯里西啶生物堿, 該生物堿是毒性最強(qiáng)的植物性肝毒物質(zhì)之一，可導(dǎo)致肝竇阻塞綜合征等臨床疾病[7]。2020年版《中國藥典》以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為白蝕丸的含量測(cè)定指標(biāo)[8]；有文獻(xiàn)對(duì)白蝕丸中二苯乙烯苷和丹皮酚進(jìn)行含量測(cè)定[9]，但對(duì)其他成分尚未有研究。因此，本研究利用UPLC-MS、HPLC等技術(shù)對(duì)白蝕丸中具潛在肝毒性的化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，為其臨床用藥安全提供參考。

1 材料

1260 Infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配備紫外檢測(cè)器；超高效液相-Micromass ZQ2000單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配備電噴霧離子源，單四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器及超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(美國沃特世公司)，配備電噴霧離子源，Q-TOF四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器; BSA124S萬分之一天平、BT25S十萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);AdvantageA10超純水儀 (美國Millipore公司)。

二苯乙烯苷(批號(hào)N1103AS)、大黃素(批號(hào)J0610AS)、大黃素甲醚(批號(hào)MB6587)、黃獨(dú)素B(批號(hào)M0305AS)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào)O0927AS)和異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)O1002AS)對(duì)照品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度大于98%；千里光堿對(duì)照品(批號(hào)PRF10071724)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%。甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇和乙腈購自美國Fisher公司；磷酸、無水乙醇、甲酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備。不同批次的白蝕丸購自廣東和陜西，190201和190202購自廣東，Y00003和Z00002購自陜西。

2 方法

2.1 白蝕丸中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量測(cè)定 參考《中國藥典》制何首烏含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行[8]。Agilent ZQRBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。二苯乙烯苷以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。大黃素和大黃素甲醚以甲醇-0.1%磷酸(80∶20)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 白蝕丸中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、黃獨(dú)素B的含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行。色譜條件為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min, 5%～15% B；2～3 min, 15%～25% B; 3～6 min, 25%～50% B; 6～10.5 min, 50%～95% B；12～14 min, 5% B)；柱溫45 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件為正離子模式下進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)；離子監(jiān)控通道m(xù)/z187.1(補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素),m/z362.1(黃獨(dú)素B)；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣(N2)體積流量50 L/h；脫溶劑氣(N2)體積流量800 L/h。

2.3 白蝕丸中吡咯里西啶生物堿的分析 參考課題組前期報(bào)道方法[12-13]，利用超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)不同類型吡咯里西啶生物堿的特征離子進(jìn)行全掃，對(duì)白蝕丸中的吡咯里西啶生物堿進(jìn)行快速篩選和鑒定。色譜條件為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相含10 mmol/L甲酸銨的0.1%氨水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min, 5%～20% B; 5～7 min, 20%～40% B; 7～8.5 min, 40%～90% B; 10～12 min, 5% B)；柱溫45 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。質(zhì)譜條件為正離子掃描模式下全掃；離子掃描范圍m/z50～800；碰撞能范圍30～35 V；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣(N2)50 L/h；脫溶劑氣(N2)800 L/h。

參考文獻(xiàn)方法[13]，利用超高效液相-Micromass ZQ2000單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)，以千里光堿為對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)白蝕丸中吡咯里西啶生物堿進(jìn)行半定量分析。選擇離子為m/z336.2(千里光堿)、m/z398.2(hydroxymyoscoripine)，其余色譜及質(zhì)譜條件與吡咯里西啶生物堿快速篩選條件相同。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、黃獨(dú)素B、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品2.25、1.49、2.50、5.00、5.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成質(zhì)量濃度分別為450、298、500、1 000、1 000 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。加甲醇分別稀釋成一系列梯度的對(duì)照品工作液。

精密稱定二苯乙烯苷對(duì)照品2.50 mg于2.5 mL量瓶中，用稀乙醇配成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。加稀乙醇稀釋成一系列梯度的對(duì)照品工作液。

精密稱定千里光堿對(duì)照品1.00 mg于10 mL量瓶中，加0.1%甲酸至刻度配置成質(zhì)量濃度為100 μg/mL對(duì)照品貯備液。加0.1%甲酸稀釋成一系列梯度的對(duì)照品工作液。

2.5 供試品溶液的制備 白蝕丸中二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚含量測(cè)定為取白蝕丸50 g，打粉，過四號(hào)篩。取本品粉末約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量；加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置濾過。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

白蝕丸中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、黃獨(dú)素B含量測(cè)定為取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量；超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置濾過。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

白蝕丸中吡咯里西啶生物堿檢測(cè)為取本品粉末約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加30 mL 0.5%甲酸超聲40 min，離心取上清，藥渣再加30 mL 0.5%甲酸超聲處理40 min，離心取上清，合并2次提取液，加氨水堿化至pH為10左右，加入二氯甲烷萃取5次，每次50 mL，室溫靜置分層后分離二氯甲烷層，合并二氯甲烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，稱定提取物質(zhì)量，加 0.1%甲酸適量制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果

3.1 白蝕丸中吡咯里西啶生物堿的快速篩選 不同類型吡咯里西啶生物堿在二級(jí)質(zhì)譜裂解時(shí)可產(chǎn)生不同的特征離子, 如retronecine型吡咯里西啶生物堿可產(chǎn)生m/z120和m/z138的特征碎片。千里光堿為retronecine型吡咯里西啶生物堿，其對(duì)照品保留時(shí)間為6.3 min (圖1A), 分子離子峰為m/z336.179 4(C18H26NO5+)(圖1B)且二級(jí)譜圖中可見明顯m/z120和m/z138特征碎片(圖1C)，與文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]相符。在白蝕丸樣本中，檢測(cè)到一個(gè)可產(chǎn)生這兩個(gè)特征離子的化合物,其保留時(shí)間為6.7 min(圖1D)，分子離子峰為m/z398.217 6(圖1E)，二級(jí)譜圖中可見明顯m/z120和m/z138特征碎片(圖1F)，初步判定其為retronecine型吡咯里西啶生物堿。進(jìn)一步根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析其分子離子峰和二級(jí)碎片的元素組成，推斷其質(zhì)譜裂解途徑(圖2), 并與文獻(xiàn)[14]比對(duì)，鑒定其為hydroxymyoscoripine。

圖1 白蝕丸樣本中吡咯里西啶生物堿質(zhì)譜圖

圖2 Hydroxymyoscoripine的二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑

3.2 白蝕丸中潛在毒性成分的含量分析 白蝕丸樣本中hydroxymyoscoripine含量測(cè)定根據(jù)課題組前期建立方法利用UPLC-MS進(jìn)行(圖1), 大黃素、大黃素甲醚和二苯乙烯苷含量測(cè)定參照藥典方法利用HPLC進(jìn)行(圖3)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、黃獨(dú)素B含量測(cè)定參考文獻(xiàn)方法利用UPLC-MS進(jìn)行(圖4)。對(duì)于方法的線性、靈敏度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等進(jìn)行考察，均符合含量測(cè)定要求。各化合物在白蝕丸樣本中的含量見表1。所有化合物中含量最高的是二苯乙烯苷，最高為10.1 mg/g，其次為異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素。同一個(gè)廠家的樣品各化合物的含量差異較小，但不同廠家的各化合物的含量差異較大。

1.二苯乙烯苷 2.大黃素 3.大黃素甲醚注：A為二苯乙烯苷對(duì)照品色譜圖(320 nm)，B為大黃素對(duì)照品色譜圖(254 nm)，C為 大黃素甲醚對(duì)照品色譜圖(254 nm)，D為白蝕丸樣品中的二苯乙烯苷色譜圖(320 nm)，E為白蝕丸樣品中的大黃素色譜圖(254 nm)，F(xiàn)為白蝕丸樣品中的大黃素甲醚色譜圖 (254 nm)。

1.補(bǔ)骨脂素 2.異補(bǔ)骨脂素 3.黃獨(dú)素B注：A為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品色譜圖(m/z 187.1)，B為黃獨(dú)素B對(duì)照品色譜圖(m/z 362.1)，C為白蝕丸樣品中的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素色譜圖(m/z 187.1)，D為白蝕丸樣品的黃獨(dú)素B色譜圖(m/z 362.1)。

3.3 白蝕丸致臨床肝損傷事件回顧與分析 回顧白蝕丸致肝損傷的臨床報(bào)道(表2), 患者服用白蝕丸均用于治療白癜風(fēng)，無其他病史?；颊呙咳辗冒孜g丸的劑量和頻次都遵循說明書，即3次/日，2.5 g/次，但服用時(shí)間較長(zhǎng)，最短20 d，最長(zhǎng)時(shí)間達(dá)108 d。中毒癥狀包括肝功能障礙、瘙癢、乏力、納差、神志不清等；住院后停止服用白蝕丸，并經(jīng)治療1周至1月后病狀消失恢復(fù)正常。

4 討論

2020年版《中國藥典》以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為白蝕丸的含量測(cè)定指標(biāo)成分，規(guī)定二者的含量之和不少于2.5 mg/g[8]。本研究首次對(duì)白蝕丸中7種潛在肝毒性成分進(jìn)行分析。檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中不同批次白蝕丸，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量之和為3.4～4.0 mg/g, 符合藥典規(guī)定。不同批次白蝕丸樣本中各化合物的含量差異較大(RSD為10%～58%)。根據(jù)結(jié)果，計(jì)算服用白蝕丸復(fù)方時(shí)攝入毒性成分的含量, 見表3。

含吡咯里西啶生物堿的植物及制品的安全性問題已引起國際性相關(guān)部門的廣泛注意，許多國家或組織都制定了相應(yīng)的法規(guī)。其中以德國衛(wèi)生部門的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，規(guī)定每日攝入草藥制品中吡咯里西啶生物堿的量不得超過1 mg，長(zhǎng)期服用(超過6個(gè)月)時(shí)則不得超過0.1 mg，外用不得超過10 mg，孕婦及哺乳期婦女不得使用[15]。盡管沒有關(guān)于hydroxymyoscoripine的毒性數(shù)據(jù)，但其為retronecine型吡咯里西啶生物堿，屬于肝毒性最強(qiáng)的類型[16]；每日服用白蝕丸攝入hydroxymyoscoripine的量為3 mg，為德國衛(wèi)生部門規(guī)定的3倍,存在著一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)。此外，白蝕丸含多種潛在毒性成分，結(jié)合白蝕丸致臨床肝損傷病例報(bào)道，白蝕丸致肝損傷可能的原因有患者長(zhǎng)期服用白蝕丸攝入多種毒性成分，通過影響藥物代謝酶增加人體對(duì)毒性成分的易感性；患者長(zhǎng)期服用白蝕丸，造成相關(guān)毒性成分在體內(nèi)蓄積致毒；多種毒性成分共同作用于機(jī)體多條信號(hào)通路，產(chǎn)生了類似協(xié)同增毒的效果，使得毒性增強(qiáng)。因此，在今后的研究中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)白蝕丸中潛在毒性成分的研究，采用基于整體動(dòng)物模型的毒效與毒代動(dòng)力學(xué)相結(jié)合的研究模式，明確其安全窗口，建立更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)其安全性，指導(dǎo)臨床合理用藥。

表1 白蝕丸中7種潛在肝毒性成分的含量(μg/g, n=3)

表2 白蝕丸致肝毒性病例回顧

表3 白蝕丸中潛在毒性成分致毒劑量及臨床患者攝入量