梁沛余， 常秀君， 馬曉雨， 韓惠竹， 夏曉曉， 吳 穹*

(1.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；2.武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430000)

十八味訶子利尿丸源自《藏醫(yī)醫(yī)訣補遺》，是由訶子、紅花、豆蔻、余甘子等藥材炮制而成的經(jīng)典藏藥復方，是藏醫(yī)臨床治療糖尿病及相關病癥的經(jīng)典方劑[1]。課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，十八味訶子利尿丸具有良好的降糖效果，可改善糖尿病大鼠“三多一少”癥狀，其機制與改善氧化應激狀態(tài)關系密切[2]。糖尿病腦病是糖尿病的重要并發(fā)癥，以認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，以神經(jīng)元損傷、炎性環(huán)境形成為重要病理特點。訶子、紅花、余甘子、蒺藜等已被證實對腦損傷具有一定的保護作用，同時課題組前期研究也已發(fā)現(xiàn)十八味訶子利尿丸對于腦缺血/再灌注損傷模型具有保護作用[3]，提示，十八味訶子利尿丸對糖尿病腦病可能具有一定的干預效能，但目前尚未見相關研究報道。

網(wǎng)絡藥理學是全面系統(tǒng)揭示藥物作用機理的新學科，為探討藏藥復方多靶點、多維度作用機理拓展了新的思路。本研究擬應用網(wǎng)絡藥理學方法探究十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病的干預機理，并經(jīng)過動物實驗對預測結(jié)果進行初步驗證，為指導藏醫(yī)臨床用藥提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 十八味訶子利尿丸所含化學成分的篩選 利用TCMSP、TCMID、CNKI數(shù)據(jù)庫檢索十八味訶子利尿丸(訶子、紅花、豆蔻、余甘子、姜黃、小檗皮、蒺藜、金礞石、刺柏、熊膽、牛黃、刀豆、山礬葉、渣馴膏、塞北紫堇、藏茜草、紫草茸、小傘虎耳草)的化學成分，并以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、血腦屏障通透性(BBB)≥-0.3、半衰期(HL)≥4為標準篩選有效化合物。

1.2 有效化合物對應靶點的篩選 利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載有效化合物結(jié)構(gòu)，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測相關靶標，同時在TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集化合物靶標，將2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果合并獲得有效化合物的潛在靶點，若2個數(shù)據(jù)庫均無收錄信息則使用CNKI數(shù)據(jù)庫進行文獻檢索。

1.3 疾病靶點篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索糖尿病腦病相關靶標，并以Relevance score ≥10、Gifts ≥40為標準篩選糖尿病腦病候選作用靶點。

1.4 藥物-疾病作用靶點篩選與GO、KEGG富集分析 利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics在線繪制Venn圖，獲得復方潛在靶點與疾病相關靶點的交集，將交集基因上傳DAVID數(shù)據(jù)庫，獲取藥物靶點生物學過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞成分(cellular components,CC)等信息，隨后進行KEGG通路分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(PPI)分析和Hub基因篩選 將藥物靶點蛋白上傳STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，利用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡可視化處理，MCODE插件篩選核心子網(wǎng)，CytoHubba插件篩選Hub基因，繪制草藥-成分-核心靶點-通路作用網(wǎng)絡。

1.6 動物實驗驗證 4周齡，體質(zhì)量80～100 g的SD大鼠，隨機分為空白組、模型組、十八味訶子利尿丸組，適應性飼養(yǎng)1周后，造模組通過高脂飲食14周+尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)20 mg/kg進行造模，7 d后血糖值>16.7 mmol/L視為糖尿病造模成功。十八味訶子利尿丸組每天灌胃給予十八味訶子利尿丸300 mg/kg，模型組則灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥6周。斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，逐級脫水后，包埋制片。蘇木精-伊紅染色法觀測神經(jīng)元損傷情況，免疫組織化學染色法觀測小膠質(zhì)細胞激活經(jīng)典標志物鈣離子結(jié)合適配分子1(IBA1)表達及篩選的核心靶點表達情況。

2 結(jié)果

2.1 十八味訶子利尿丸有效成分庫和對應靶點庫的構(gòu)建 復方有效成分庫共含有效化合物成分31個，其中訶子4個，紅花9個，蒺藜7個，余甘子1個，姜黃3個，刀豆2個，牛黃1個，豆蔻7個，渣馴膏1個，小檗皮2個(圖1A)；十八味訶子利尿丸靶點庫共含作用靶點582個，其中訶子202個，紅花338個，蒺藜53個，余甘子77個，姜黃72個，刀豆72個，牛黃4個，豆蔻316個，渣馴膏37個，小檗皮96個。

2.2 糖尿病腦病疾病靶點庫的構(gòu)建 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索糖尿病腦病全部靶點，共獲得2 556個靶點信息，以Relevance score≥10、Gifts≥40為篩選標準，共獲得候選靶點537個(圖1B)。

圖1 藥物靶點篩選

2.3 藥物作用靶點篩選和有效成分-靶點網(wǎng)絡建立 將復方對應靶點庫與糖尿病腦病疾病靶點庫利用Venn圖進行比對，發(fā)現(xiàn)107個共有靶點(圖1C)，說明這107個基因在復方干預糖尿病腦病中發(fā)揮了重要作用。利用Cytoscape軟件構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡，共發(fā)現(xiàn)24個有效成分可與107個靶點形成映射關系(圖2)，映射靶點數(shù)量前5名化合物為紅花-baicalein(31個靶點)、紅花-lignan(26個靶點)、豆蔻-dehydrodiisoeugenol(24個靶點)、豆蔻-jaranol(23個靶點)、訶子-cheilanthifoline(22個靶點)，這5種化合物靶點映射數(shù)目占總映射的39.5%。

圖2 十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病成分-靶點圖

2.4 藥物作用靶點GO功能和KEGG通路分析 107個基因靶點GO功能分析發(fā)現(xiàn)生物學過程主要富集在血管生成的正向調(diào)控、脂多糖調(diào)控的信號通路、多肽絲氨酸磷酸化的正向調(diào)控、活性氧代謝的正向調(diào)控、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)級聯(lián)信號的正向調(diào)控等過程(圖3A)；細胞成分主要富集在胞質(zhì)、軸突、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等位置(圖3B)；分子功能主要富集在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活力、腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate, ATP)結(jié)合、血紅素結(jié)合等功能(圖3C)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要在缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)信號、催乳激素信號、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)信號等多通路富集(圖3D)，結(jié)果表明復方藏藥十八味訶子利尿丸發(fā)揮作用是多靶點、多通路、多維度的系統(tǒng)綜合效果。

圖3 十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病靶點GO和KEGG分析

圖4 十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病靶點PPI網(wǎng)絡分析

2.5 藥物作用靶點PPI網(wǎng)絡分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建藥物作用靶點PPI網(wǎng)絡，并利用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡可視化處理，發(fā)現(xiàn)107個基因均參與構(gòu)成網(wǎng)絡，網(wǎng)絡含1 567條邊(圖4A)，說明復方作用靶點間存在復雜的網(wǎng)絡調(diào)控關系。緊接著通過MCODE插件篩選核心子網(wǎng)模塊，發(fā)現(xiàn)67個基因組成5個核心子網(wǎng)，其中41個基因可構(gòu)成1個含678條邊構(gòu)成的大子網(wǎng)模塊(Score 33.9)(圖4B)，其余26個基因構(gòu)成Score≤6的4個小子網(wǎng)模塊(圖4C)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對41個基因構(gòu)成的大子網(wǎng)進行KEGG通路分析，結(jié)果顯示核心大子網(wǎng)基因主要富集于HIF信號、TNF信號、Toll樣受體信號等相關通路(圖4D)。

2.6 藥物作用靶點Hub基因篩選 基于構(gòu)建的107個基因靶點PPI網(wǎng)絡，利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件多算法篩選前20位的候選Hub基因，結(jié)果如表1所示，利用白組比較，模型組動物腦內(nèi)高表達PTGS2；與模型組比較，給予十八味訶子利尿丸干預可降低PTGS2的表達(圖6B)，證實十八味訶子利尿丸確實可通過多成分靶向PTGS2進而調(diào)控糖尿病腦病進程，與網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果相符。

表1 CytoHubba插件篩選候選Hub基因(前20位)

Venn圖對篩選結(jié)果進行交集(圖5A)，發(fā)現(xiàn)TLR4、MMP9、PTGS2、MAPK3、MAPK14、ALB是在多種算法中均排于前20位的Hub基因，PPI網(wǎng)絡顯示基因間存在互作關系(圖5B)，也參與構(gòu)建41個基因核心大子網(wǎng)模塊。對6個基因在HIF信號、TNF信號、Toll樣受體信號、催乳素信號、雌激素信號、VEGF信號等通路的富集情況進行探究，發(fā)現(xiàn)TLR4、MMP9、PTGS2、MAPK3、MAPK14 5個Hub基因富集于相關信號中，構(gòu)成如圖5C所示的藥材-成分-靶點-通路調(diào)控網(wǎng)絡，5個Hub基因的相關有效成分的藥物代謝動力學參數(shù)如表2所示。

2.7 實驗驗證 Hub基因與有效成分的映射分析顯示前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)是多種有效成分的共同作用靶點，可與20種關鍵有效成分中的18種存在映射關系，具有最高的成分-靶點映射數(shù)量(圖6A)，同時由于其可廣泛參與炎癥、應激等過程，故選取PTGS2作為靶點蛋白進行驗證。實驗研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組動物精神萎靡，腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元核固縮壞死，伴小膠質(zhì)細胞過度激活；與模型組比較，給予十八味訶子利尿丸干預可改善動物精神狀態(tài)，減輕糖尿病所致神經(jīng)元損傷，并降低小膠質(zhì)細胞炎性活化(圖6B)。免疫組化研究顯示，與空白組比較， 模型組動物腦內(nèi)高表達PTGS2;與模型組比較，給予十八味訶子利尿丸干預可降低PTGS2的表達(圖6B)，證實十八味訶子利尿丸確實可通過多成分靶向PTGS2進而調(diào)控糖尿病腦病進程， 與網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果相符。

圖5 十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病 Hub基因靶點篩選

表2 有效成分的藥理學和分子特性

圖6 十八味訶子利尿丸干預糖尿病腦病大鼠的病理變化

3 討論

糖尿病腦病是糖尿病發(fā)生過程中常見的并發(fā)癥，常以認知功能障礙、語言表達能力下降等為主要臨床表現(xiàn)，糖尿病人群患有老年癡呆的發(fā)生率明顯高于其他人群[4]。藏醫(yī)藥有著完善的理論體系和豐富的臨床實踐經(jīng)驗[5-6]。十八味訶子利尿丸是藏醫(yī)臨床上常用的糖尿病治療方劑，有臨床研究顯示，相比于常規(guī)用藥的糖尿病患者，十八味訶子利尿丸干預有著更高的臨床有效率和更低的不良反應率[7]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學系統(tǒng)探討了十八味訶子利尿丸治療糖尿病腦病的作用機制，并通過動物實驗對關鍵靶點進行初步驗證。

糖尿病腦病發(fā)生與神經(jīng)免疫炎癥關系密切，臨床研究顯示，糖尿病腦病患者血清炎性因子水平高于正常人及無認知功能障礙的糖尿病患者，炎性因子水平與認知功能呈負相關，且機體炎癥出現(xiàn)早于認知功能障礙[8]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細胞，具有釋放炎性因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等功能[9]。Hwang等[10]發(fā)現(xiàn)相比于12周齡糖尿病早期階段，30周齡慢性糖尿病階段大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的特異性激活標志物IBA1的表達升高，其周圍白介素1β的表達也上升，提示炎性激活的小膠質(zhì)細胞會促進糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的損傷及衰老進程。體外研究則證實，高糖刺激下小膠質(zhì)細胞可被激活，并上調(diào)TNF、iNOS等炎性基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Toll樣受體4的表達，并且高糖對小膠質(zhì)的激活作用與Toll受體經(jīng)典激動劑脂多糖相當[11]。本研究顯示，十八味訶子利尿丸可通過多成分映射到糖尿病腦病的107個作用靶點上，其中TNF信號、Toll樣受體信號這2條經(jīng)典炎性通路可能是其發(fā)揮抗糖尿病腦病的重要通路。驗證實驗顯示，十八味訶子利尿丸可降低大鼠小膠質(zhì)細胞的炎性激活。十八味訶子利尿丸有效成分中，berberine可改善糖尿病大鼠的學習記憶障礙，減輕神經(jīng)元軸突病變，其機制與調(diào)控NF-κB的核轉(zhuǎn)位進而調(diào)控炎癥介質(zhì)的釋放關系密切[12]；ellipticine[13]、sitosterol[14]也被報道其在體外可抑制脂多糖激活下的巨噬細胞TNF-α、IL-6的生成。因此，十八味訶子利尿丸多成分、多靶點的抗炎效應可能是其治療糖尿病腦病的核心機制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PTGS2是十八味訶子利尿丸多成分的共同靶標，其參與炎性信號調(diào)控，在組織損傷、炎癥等情況下表達增強[15]，已被證實廣泛參與多種急慢性神經(jīng)損傷，其在老年糖尿病患者腦內(nèi)高表達[16]。PTGS2可通過促進其下游前列腺素PGD2與其受體DPs的結(jié)合進而調(diào)控神經(jīng)元自噬影響糖尿病發(fā)病進程中高糖環(huán)境對神經(jīng)元的損傷作用[17]。糖尿病造模6個月后，小鼠可出現(xiàn)神經(jīng)傳導減慢，氧化應激，炎癥反應等表現(xiàn)，COX-2-/-的糖尿病小鼠則無明顯神經(jīng)功能缺失[18]。這些結(jié)果說明，PTGS2在糖尿病所致腦損傷中發(fā)揮了重要作用，本研究也證實十八味訶子利尿丸可靶向PTGS2表達減輕糖尿病所致大鼠神經(jīng)元損傷。

綜上所述，十八味訶子利尿丸可通過多成分、多靶點、多維度發(fā)揮對糖尿病腦病的保護作用，本研究為進一步拓展經(jīng)典藏藥復方的臨床應用提供了新思路。