楊 朋， 錢 軍， 陳文飛， 鄧懷冬

(攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 攀枝花 617000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高的特點，對人類健康造成巨大威脅[1-2]。非小細胞肺癌占全部肺癌患者的75%～85%，其侵襲能力強、預(yù)后差[3]。由于肺癌的發(fā)病機制復(fù)雜且尚未闡明，目前尚無治愈肺癌的根本方法[4]。目前，手術(shù)治療、放療和化療仍為臨床上治療肺癌的主要手段，手術(shù)治療雖在一定程度上能緩解疾病進程，但復(fù)發(fā)率較高；放療因存在較大的副作用，應(yīng)用受到限制；化療在一定程度上改善患者癥狀和生活質(zhì)量，但存在廣泛的耐藥性[4-5]。因此，尋找安全、有效的新型肺癌治療藥物意義重大。

木犀草素是一種天然黃酮化合物，廣泛存在于芹菜、西蘭花、蘋果等蔬菜和水果中，具有多種生理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護等[6-8]。本研究以人非小細胞肺癌A549細胞為對象，探討木犀草素對其活力、凋亡和自噬的影響，為木犀草素的進一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞 人非小細胞肺癌A549細胞購于中國科學(xué)院昆明細胞庫。

1.2 試劑與藥物 木犀草素(純度98%，批號L107328)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。噻唑藍(MTT)購于美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；青鏈霉素溶液、Hoechst 33258染液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；10×RIPA裂解液、cleaved-caspase-9(貨號9505)、caspase-9(貨號9502)、cleaved-caspase-3(貨號9664)、caspase-3(貨號9662)、Bax(貨號2772)、Bcl-2(貨號3498)、LC-3(貨號4108)、p-PI3K(貨號4228)、PI3K(貨號4255)、p-Akt(貨號4060)、Akt(貨號2920)、p-mTOR(貨號5536)、mTOR(貨號2972)、β-actin(貨號3700)抗體、HRP標記二抗兔(貨號7074)購于美國Cell Signaling Technology公司；pEGFP-LC3質(zhì)粒(PPL00363-2a)購于質(zhì)粒與蛋白共享庫；ExFect2000轉(zhuǎn)染試劑購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞于含10% FBS、1%青鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。細胞融合度達70%～80%時傳代或用于實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的A549細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后以200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L木犀草素分別干預(yù)A549細胞12、24、36 h，棄上清液，向各孔加入含0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后輕輕吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振搖5 min，于570 nm波長處測定各孔吸光度，并以對照組平均值為基準計算各組相對細胞活力。

2.3 細胞分組及給藥 取對數(shù)生長期的A549細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板，分為對照組和木犀草素低、中、高劑量組(12.5、25、50 μmol/L)，待細胞貼壁后開始干預(yù)，各組同時干預(yù)24 h。

2.4 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡 細胞按“2.3”項下方法分組及給藥，干預(yù)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，用PBS潤洗2次，每孔加1 mL預(yù)冷的4%多聚甲醛，于4 ℃固定20 min，然后棄多聚甲醛，PBS潤洗2次，每孔加1 mL Hoechst 33258染液，室溫染色5 min，PBS潤洗細胞，于倒置熒光顯微鏡拍照。

2.5 Western blot檢測蛋白表達 細胞按“2.3”項下方法分組及給藥，干預(yù)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，PBS潤洗細胞，每孔加100 μL 1×RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，收集細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液即得總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，加入5×Loading buffer混勻，95 ℃加熱5 min后，渦旋混勻后上樣。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，次日棄一抗，加入二抗室溫孵育1 h，然后用ECL發(fā)光液顯影。

2.6 轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒并觀察木犀草素對A549細胞自噬斑點形成的影響 細胞按“2.3”項下方法分組，待細胞貼壁后，按說明書方法向A549細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒，每孔2 μg，轉(zhuǎn)染16 h后，按“2.3”項下方法給藥，干預(yù)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，PBS潤洗細胞，每孔加1 mL預(yù)冷的4%多聚甲醛，于4 ℃固定20 min，棄多聚甲醛后用PBS潤洗，于倒置熒光顯微鏡拍照。

3 結(jié)果

3.1 木犀草素抑制A549細胞活力 A549細胞經(jīng)不同濃度木犀草素分別干預(yù)12、24、36 h后，細胞活力呈劑量和時間依賴性降低(P<0.01)，24、36 h的IC50分別為29.88、22.41 μmol/L，見圖1。

注：與對照組比較，**P<0.01。

3.2 木犀草素誘導(dǎo)A549細胞凋亡 Hoechst 33258染色后，活細胞核呈彌散均勻熒光，熒光強度較弱；細胞凋亡后細胞核和胞質(zhì)呈濃染致密的斑塊，熒光強度增強。如圖2所示，木犀草素可劑量依賴性地增加A549細胞Hoechst 33258染色熒光強度(P<0.05，P<0.01)，表明木犀草素可誘導(dǎo)A549細胞凋亡。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 木犀草素促進凋亡相關(guān)蛋白表達 caspase-9和caspase-3的在細胞凋亡進程中具有重要作用，其活化后可啟動細胞凋亡。如圖3所示，木犀草素劑量依賴性地促進caspase-9和caspase-3的裂解和活化(P<0.01)，促進Bax表達和抑制Bcl-2表達(P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01。

3.4 木犀草素提高A549細胞自噬標志蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值 自噬是細胞一種重要的程序性死亡方式，有研究表明激活自噬可能是抑制腫瘤的有效途徑。自噬標志蛋白LC-3是反應(yīng)細胞自噬活性的經(jīng)典標志物，木犀草素可劑量依賴性地提高LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值(P<0.01)，表明木犀草素可激活A(yù)549細胞自噬，見圖4。

注：與對照組比較，**P<0.01。

3.5 木犀草素促進A549細胞自噬斑點形成 如圖5所示，木犀草素可劑量依賴性地促進A549細胞自噬斑點的形成(P<0.01)，進一步說明了木犀草素對自噬的激活作用。

3.6 木犀草素抑制A549細胞PI3K/Akt/mTOR通路 如圖6所示，木犀草素抑制p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(P<0.05，P<0.01)，提示PI3K/Akt/mTOR通路被抑制，說明木犀草素激活自噬可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。

4 討論

細胞的死亡方式通常有2種，即細胞壞死和程序性死亡，而凋亡和自噬性死亡是2類最為重要的細胞程序性死亡，對于清除體內(nèi)異常細胞維持機體健康至關(guān)重要[9-11]。目前有大量研究表明，凋亡和自噬是抑制腫瘤進程的重要途徑[12-13]。木犀草素具有顯著的抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用，亦有研究表明木犀草素可抑制食管癌、卵巢癌和肺癌細胞的增殖和遷移[14-15]，但關(guān)于木犀草素對肺癌細胞的凋亡和自噬的研究較少，且相關(guān)的分子機制尚不清楚。本實驗以最常用的人非小細胞肺癌A549細胞為對象，首先研究了木犀草素對A549細胞活力的影響，結(jié)果顯示，木犀草素能夠抑制A549細胞活力，Hoechst 33258染色結(jié)果亦表明木犀草素能夠促進A549細胞凋亡，說明木犀草素對A549細胞具有良好的抑制作用，這與之前的研究結(jié)果一致[7,16]。

凋亡是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，涉及到包括Bcl-2以及Bcl-2家族成員Bad和Bax在內(nèi)的許多基因和蛋白[11]。誘導(dǎo)細胞凋亡有2種途徑，一種是由細胞間信號激活的內(nèi)在途徑，也稱為線粒體途徑；另一種是由細胞外信號激活的外在途徑，也稱為死亡受體途徑，而caspase蛋白酶家族是上述2種凋亡途徑的關(guān)鍵因子。本研究結(jié)果顯示，木犀草素可促進Bax表達，抑制Bcl-2蛋白表達，從而提升了Bax/Bcl-2比值，降低了凋亡發(fā)生的閾值，隨后促進caspase-9裂解形成活化態(tài)的cleaved-caspase-9，進一步促進了caspase-3的裂解和活化并激活其下游底物如PARP，最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。

注：與對照組比較，**P<0.01。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

自噬與腫瘤發(fā)生、細胞發(fā)育和死亡密切相關(guān)，可降解受損細胞器和錯誤折疊蛋白質(zhì)，為細胞代謝提供物質(zhì)來源和能量，而過度自噬則導(dǎo)致細胞死亡，即自噬性死亡[17-18]。本研究結(jié)果表明，木犀草素可促進LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)化，同時促進自噬斑點的形成，說明木犀草素可促進A549細胞自噬。在調(diào)節(jié)自噬活性的眾多信號通路中，PI3K/Akt/mTOR被認為具有關(guān)鍵作用[19]。PI3K/Akt/mTOR是一種促生存信號，調(diào)控細胞增殖、分化和遷移等功能，在癌細胞中常被激活，從而延緩腫瘤細胞凋亡，促進增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR通路可能導(dǎo)致腫瘤細胞自噬性死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可降低PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平從而抑制PI3K/Akt/mTOR通路，說明木犀草素促進自噬可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。

綜上所述，木犀草素可能通過凋亡和自噬2條途徑促進A549細胞死亡，進一步闡明了木犀草素對非小細胞肺癌A549細胞的抑制效果，為木犀草素進一步開發(fā)成為新型抗非小細胞肺癌藥物奠定了基礎(chǔ)。