孫開芬， 陳胤睿， 徐文芬， 舒燕霞， 石興雨

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

紅禾麻為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻L(zhǎng)aporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的新鮮或干燥全草，功效祛風(fēng)除濕、活血化瘀、止痛、止癢，為貴州地方標(biāo)準(zhǔn)收載的少數(shù)民族苗族習(xí)用藥材，常鮮用以酒泡服，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的療效[1-4]，有著抗炎鎮(zhèn)痛[5-9]、抗風(fēng)濕[10-12]、降脂[13]等作用，課題組前期研究表明，其提取物具有抗炎、抗氧化活性[14-15]。隨著對(duì)紅禾麻化學(xué)成分和藥理作用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)黃酮是該藥材主要成分，而且對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有較好的療效。

目前，大孔吸附樹脂以適用范圍廣、吸附量大、解析條件柔和、選擇性強(qiáng)、易于再生、成本低等優(yōu)點(diǎn)[16]，被廣泛應(yīng)用于中藥及民族藥中黃酮、生物堿、萜類、皂苷等常規(guī)的分離純化[17-22]，但目前尚無關(guān)于紅禾麻總黃酮的相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大孔吸附樹脂分離純化紅禾麻總黃酮工藝，以期為該成分藥理活性深入研究、相關(guān)新藥開發(fā)、相關(guān)制劑綠色制造奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 UV-1800型紫外分光光度儀(日本島津公司)；AG135電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；FA3204B電子分析天平(上海天美天平儀器有限公司)；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；BS-1E振蕩和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱(常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FN101-2A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(長(zhǎng)沙儀器儀表廠)。

1.2 試劑與藥物 紅禾麻采自貴州省雷山縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻L(zhǎng)aporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的地上部分。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100080-201610，純度92.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。HP20、HPD300、HPD722型大孔吸附樹脂(鄭州和成新材料科技有限公司)；D101、AB-8型大孔吸附樹脂(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)。結(jié)晶氯化鋁(批號(hào)20170926，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。乙醇為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[23]報(bào)道。

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品8.20 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.303 7 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 顯色反應(yīng)液制備 稱取結(jié)晶氯化鋁(AlCl3·6H2O)適量，加水溶解，定容至50 mL量瓶中，制成10% AlCl3溶液，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于10 mL量瓶中，加入10% AlCl3溶液2 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，40 ℃水浴顯色反應(yīng)30 min，取出，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=27.3X-0.004 5(r=0.999 7)，在9.111～24.30 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 浸膏制備 稱取2.0 kg藥材粉末，30倍量70%乙醇回流提取1 h，濾過，濾渣用20倍量70%乙醇再回流提取1 h，濾過，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑得到稠浸膏，水浴蒸干，即得(共0.6 kg)。

2.1.5 測(cè)定方法 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，搖勻，精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法加入顯色試劑，蒸餾水定容至刻度，40 ℃水浴顯色反應(yīng)30 min，取出，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果為2.111 mg/mL。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液0.8 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，在406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其RSD為1.21%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，平行6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，在406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，于0、2、4、6、12、24、48 h在406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為2.11%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取總黃酮含量已知的浸膏液6份，每份1 mL，分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，在406 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，總黃酮平均加樣回收率為99.81%，RSD為0.98%。

2.2 樹脂預(yù)處理 取D101、AB-8、HPD300、HP20、HPD722樹脂適量，在95%乙醇中浸泡24 h使其充分溶脹，取出裝柱，95%乙醇以最大體積流量沖洗，蒸餾水以同樣體積流量沖洗至無醇味，收集洗凈樹脂，濾去水，備用。

2.3 靜態(tài)吸附研究

2.3.1 樹脂篩選 稱取預(yù)處理后抽濾至干的5種樹脂各3 g，平行3份，置于100 mL錐形瓶中。取浸膏1.5 g，加入50 mL蒸餾水，超聲溶解至無明顯顆粒，加入裝有樹脂的錐形瓶中，置于恒溫振蕩箱(25 ℃，120 r/min)中振蕩24 h，濾過，取續(xù)濾液，計(jì)算樹脂對(duì)總黃酮的吸附率、比吸附量，公式分別為吸附率=[(C0V0-C1V1)/C0V0]×100%、比吸附量=(C0V0-C1V1)/M(C0為吸附前總黃酮初始質(zhì)量濃度，V0為吸附前上樣液體積，C1為吸附后總黃酮質(zhì)量濃度，V1為吸附后溶液體積，C2為解吸后總黃酮質(zhì)量濃度，V2為解吸后溶液體積，M為樹脂質(zhì)量)。將吸附飽和的樹脂用適量水沖洗，濾干，置于100 mL錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，置于恒溫振蕩箱中振蕩24 h，進(jìn)行靜態(tài)解吸，計(jì)算樹脂對(duì)總黃酮的解吸率、比吸附量，公式分別為解吸率=[C2V2/(C0V0-C1V1)]×100%、比解吸量=C2V2/M，結(jié)果見表1。由此可知，D101型樹脂對(duì)總黃酮的吸附率、比吸附量、解吸率、比解吸量最高，故選擇其用于總黃酮富集純化。

2.3.2 靜態(tài)吸附曲線繪制 取預(yù)處理后抽濾至干的D101型樹脂約3 g，精密稱定，共14份，置于100 mL錐形瓶中，取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，加入裝有樹脂的錐形瓶中，置于恒溫振蕩箱(25 ℃、120 r/min)中振蕩，于30、60、90、120、180、240、300、360、460、660、860、1 060、1 260、1 440 min各取出1個(gè)錐形瓶，測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線，見圖1。由此可知，樹脂吸附過程發(fā)生了3個(gè)階段變化，并在360 min后逐漸達(dá)到平衡：第一階段，吸附能力在前120 min內(nèi)呈線性快速上升趨勢(shì)；第二階段，在120～360 min時(shí)吸附能力增加較緩慢；第三階段，在360 min后樹脂達(dá)到吸附平衡。

圖1 D101型樹脂靜態(tài)吸附曲線

2.4 動(dòng)態(tài)吸附研究

2.4.1 泄露曲線繪制 取預(yù)處理后的D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏6.0 g，加入200 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，以1.0 mL/min體積流量上樣，每10 mL收集1份流出液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線，當(dāng)流出液中該成分質(zhì)量濃度為上樣液的1/10時(shí)，可認(rèn)為達(dá)到泄露點(diǎn)[24]，結(jié)果見圖2?？傸S酮初始質(zhì)量濃度為2.111 mg/mL，在第5份流出液中為0.233 4 mg/mL，即已達(dá)到泄露點(diǎn)，故選擇上樣體積為50 mL。

圖2 總黃酮在D101型樹脂上的泄露曲線

2.4.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 精密稱取預(yù)處理好的D101型樹脂6份，每份10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約為19 mL)，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏0.4、0.7、1.0、1.2、1.5、2.0 g，超聲溶解于50 mL蒸餾水中，以1.0 mL/min體積流量上樣，動(dòng)態(tài)吸附4 h后，加入3 BV(1 BV=19 mL)蒸餾水于吸附柱中進(jìn)行水洗，收集未吸附液與水洗液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總黃酮吸附率、比吸附量，結(jié)果見圖3。由此可知，總黃酮吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度增加而降低，而比吸附量恰好相反；當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到2.111 mg/mL后，相同時(shí)間動(dòng)態(tài)吸附使其吸附率趨于平衡狀態(tài)。由于上樣液質(zhì)量濃度太低不足以使樹脂吸附飽和，而太高又會(huì)浪費(fèi)浸膏和試劑，最終確定其質(zhì)量濃度不超過2.200 mg/mL，浸膏質(zhì)量約為1.5 g。

圖3 不同上樣液質(zhì)量濃度下總黃酮吸附率、比吸附量

2.4.3 上樣體積流量對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 取預(yù)處理后的D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，分別以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min體積流量上樣，動(dòng)態(tài)吸附4 h后加入3 BV蒸餾水于吸附柱中，對(duì)樹脂進(jìn)行水洗，收集未吸附液與水洗液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算上樣液質(zhì)量濃度吸附率，結(jié)果見圖4。由此可知，上樣體積流量為1 mL/min 時(shí)，會(huì)造成樹脂柱堵塞，不利于吸附(提取液中富含多糖而較黏稠)；為4 mL/min時(shí)，樹脂柱不易堵塞，而且增加了動(dòng)態(tài)吸附次數(shù)，使吸附率最高，達(dá)87.25%。最終確定，上樣體積流量為4 mL/min。

圖4 不同上樣體積流量下總黃酮吸附率

2.4.4 徑高比對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 取預(yù)處理后的D101型樹脂約7、10、12、15 g(濕質(zhì)量，柱床體積約13、19、22、27 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比分別為1∶5、1∶7、1∶8、1∶10，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，以4.0 mL/min體積流量通過樹脂柱，動(dòng)態(tài)吸附4 h后加入3 BV蒸餾水，對(duì)樹脂進(jìn)行水洗，收集未吸附液與水洗液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總黃酮吸附率、比吸附量。結(jié)果，不同徑高比下總黃酮吸附率分別為76.64%、85.56%、88.44%、90.87%，比吸附量分別為11.560、9.031、7.779、6.395 mg/g，即徑高比為1∶5時(shí)雖然比吸附量最大，但吸附率最低，吸附不完全，而隨著徑高比增加比吸附量逐漸減小，說明徑高比越小，對(duì)浸膏和試劑浪費(fèi)越多；徑高比越大，樹脂吸附越不飽和，對(duì)樹脂浪費(fèi)越多。最終確定，徑高比為1∶7。

2.4.5 水洗用量對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸率的影響 取預(yù)處理后的D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共5份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g至50 mL蒸餾水中，超聲處理至無明顯顆粒，以4.0 mL/min體積流量通過樹脂柱，動(dòng)態(tài)吸附4 h后分別加入3、6、9、12、15 BV蒸餾水洗脫，收集水洗液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見圖5。由此可知，水洗用量為3～9 BV時(shí)，總黃酮含量平穩(wěn)；為9～12 BV時(shí)，其含量明顯升高，但繼續(xù)加大時(shí)可能會(huì)對(duì)已被樹脂吸附的該成分造成一定損失。最終確定，水洗用量為9 BV。

圖5 不同水洗用量下總黃酮含量

2.4.6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮洗脫量的影響 取預(yù)處理后的 D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，以4 mL/min體積流量上樣，動(dòng)態(tài)吸附4 h后加入9 BV蒸餾水除雜，依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇及無水乙醇各3 BV梯度洗脫，分段收集洗脫液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總黃酮洗脫量，結(jié)果見圖6。由此可知，5%乙醇就可逐漸洗脫總黃酮，30%、40%乙醇能將大部分該成分洗脫出來，80%、90%、無水乙醇幾乎洗脫不出。綜合考慮對(duì)總黃酮的最大富集效果及對(duì)溶劑的綠色節(jié)約，最終確定洗脫劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)洗脫劑下總黃酮洗脫量

2.4.7 洗脫劑用量對(duì)總黃酮洗脫效果的影響 取預(yù)處理后的D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共5份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g，溶于50 mL蒸餾水中，將2.111 mg/mL總黃酮溶液以4 mL/min體積流量上樣，動(dòng)態(tài)吸附4 h后用9 BV蒸餾水除雜，再分別用3、6、9、12、15 BV 70%乙醇以1 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算洗脫率。結(jié)果，不同洗脫劑用量下洗脫率分別為82.49%、87.34%、91.78%、97.65%、97.57%，即總黃酮洗脫效果隨著洗脫劑用量增加而逐漸加強(qiáng)，當(dāng)其用量為12 BV時(shí)達(dá)到平衡。最終確定，洗脫劑(70%乙醇)用量為12 BV。

2.4.8 洗脫劑體積流量對(duì)總黃酮洗脫效果的影響 取預(yù)處理后的D101型樹脂約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g溶于50 mL蒸餾水中，以4 mL/min體積流量上樣，動(dòng)態(tài)吸附4 h后，9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定406 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算洗脫率。結(jié)果，不同洗脫劑體積流量下洗脫率分別為87.04%、84.51%、79.43%、75.38%，即總黃酮洗脫率隨著洗脫劑體積流量增加而降低，為3、4 mL/min時(shí)，不利于洗脫溶液與總黃酮之間的相互作用，而且時(shí)間較短，導(dǎo)致洗脫率較低；為1 mL/min時(shí)，延長(zhǎng)了洗脫劑與總黃酮的作用時(shí)間，從而洗脫率最高。最終確定，洗脫劑體積流量為1 mL/min。

2.4.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)，確定最優(yōu)工藝為D101型樹脂10 g，浸膏質(zhì)量1.5 g(總黃酮質(zhì)量濃度約為2.111 mg/mL)，上柱體積50 mL，上樣體積流量 4 mL/min，徑高比1∶7，洗脫時(shí)先以9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇洗脫，洗脫體積流量為1 mL/min。稱取5份預(yù)處理后的D101型樹脂，每份約10 g(濕質(zhì)量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，吸取2.111 mg/mL總黃酮溶液50 mL，以4 mL/min體積流量上樣，待吸附飽和后用9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇以1.0 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算總黃酮洗脫量、洗脫率，結(jié)果見表2。由此可知，優(yōu)化工藝對(duì)總黃酮具有較好的分離富集效果，D101型樹脂可大大提高該成分純度。

表2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察5種大孔吸附樹脂對(duì)紅禾麻總黃酮的吸附、解吸性能，發(fā)現(xiàn)非極性樹脂(HPD300、HP20、D101型)吸附率、解吸率高于弱極性樹脂(AB-8、HPD722型)。再通過靜態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D101型大孔吸附樹脂的效果最好，故選擇其進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

黃酮為紅禾麻活性成分，具有抗炎、抗氧化活性[15]，但不同批次之間該成分含量差異較大，僅以其為指標(biāo)評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)過于片面，故本實(shí)驗(yàn)選擇總黃酮作為研究對(duì)象。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了體積流量5 mL/min對(duì)總黃酮含量的影響，發(fā)現(xiàn)上樣液黏稠，即使將吸附柱控制閥調(diào)至完全也不能得到該數(shù)值，最高僅接近于4 mL/min，故本實(shí)驗(yàn)只考察了1、2、3、4 mL/min。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅禾麻總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)從7.04%升至23.89%，固形物含量由1.50 g減少至0.38 g，表明大孔吸附樹脂純化工藝合理可行，可用于后期相關(guān)研究。