李曉峰，許文劍，衛(wèi) 星，張志強

轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白基因（transformation-related protein 53 gene，tp53）是常見的抑癌基因之一，可轉(zhuǎn)錄激活靶基因以響應氧化應激或DNA 損傷等細胞應激[7]，調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程[8]，但胰腺癌患者的tp53 基因圖譜尚不清楚。 因此，筆者分析胰腺癌患者血液ctDNA 與腫瘤組織中tp53 基因突變特征及一致性，并結(jié)合患者臨床病理特征分析影響一致性的相關(guān)因素， 以期為胰腺癌患者ctDNA 檢測的臨床應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

選擇2018 年2 月至2021 年12 月于內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院就診的胰腺癌患者168 例， 其中男性99例，女性69 例；年齡34 ～78 歲，平均年齡56.63 歲（標準差5.85 歲）；頭頸部胰腺癌89 例，體位部胰腺癌79 例； 腫瘤直徑≤5 cm 者67 例，＞5 cm 者101例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～Ⅳ期123 例；依據(jù)分化程度：高分化81 例，中分化59 例，低分化28 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者127 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41 例。筆者研究經(jīng)所在醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批號：NH20171129）；納入患者均知情并簽署基于《赫爾辛基宣言》擬定的知情同意書。

選擇標準：①年齡≥18 歲；②組織病理診斷為胰腺癌；③接受ctDNA 檢測；④臨床資料完整。

排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并感染或凝血系統(tǒng)疾??； ③組織學標本與ctDNA 標本間隔時間超過2 周；④合并遺傳性疾病。

1.2 方法

1.2.1 樣本提取

采用Streck 采血管 （Streck Inc, San Francisco，CA，美國）收集空腹外周血10 mL，于4 ℃、1 600×g條件下離心10 min 后，吸取離心血漿，再于4 ℃、16 000×g 條件下離心10 min， 去除殘留細胞碎片，將分離的血漿冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

采集患者手術(shù)病灶組織樣本，病灶組織樣本腫瘤細胞比例應＞10%，石蠟包埋，3 ～5 μm 切片，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臨床資料收集

對貴鉛樣品進行測定，并對大量試驗數(shù)據(jù)進行總結(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)貴鉛樣品中主要共存雜質(zhì)元素的質(zhì)量分數(shù)范圍分別如下所示：鉛，15.2%～75.5%；銻，1.6%～38.9%；鉍，0.4%～19.5%；鐵，0.2%～12.4%；銅，1.8%～6.3%；砷，1.9%～4.2%；碲，0.3%～1.8%。

通過查閱電子病歷收集患者臨床資料， 包括性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移器官數(shù)等。

1.2.3 DNA 定量和提取

采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kits（Qiagen，Hilden， 德國） 分離血漿ctDNA， 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）提取外周血DNA 作為對照， 采用black PREP FFPE DNA Kit（Analytik Jena AG，Jena，德國）提取樣本組織DNA，- 80 ℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DNA 的文庫構(gòu)建、捕獲與上機測序

使用Qubit 熒光儀 （Invitrogen，Carlsbad，CA，美國） 和Qubit dsDNA High-sensitivity （HS） Assay Kit（Invitrogen，美國）測定DNA 濃度。 使用Agilent 2100 Bioanalyzer （Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）和DNA HS kit（Agilent Technologies，美國）分析ctDNA 的大小分布。 采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0 文庫構(gòu)建試劑盒，對DNA 進行多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）建庫，采用Ion Library TaqManTMQuantification Kit 試劑盒對擴增產(chǎn)物進行文庫定量， 并采用Illumina Hiseq3000 對文庫進行雙末端測序。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)分析

剔除低質(zhì)量的讀數(shù)和末端接頭序列， 采用Burrows Wheeler Aligner（Version 0.7.12-r1039）校對原始測序堿基序列， 并使用Genome Analysis Toolkit（GATK，版本3.4-46-gbc02625）對比reads 序列，采用Varscan 2（v2.4.2）對樣本進行突變檢測，用GATK識別人群多態(tài)性位點。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 計數(shù)資料采用χ2檢驗， 計量資料采用t 檢驗。 采用Kappa 值符合率評價ctDNA 與組織DNA 檢測tp53基因突變的一致性，多因素分析采用Logistic 回歸模型進行。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與血漿tp53 基因突變情況

129 例患者進行了組織tp53 基因檢測，168 例患者均接受血漿ctDNA 檢測。 組織標本中tp53 突變率為30.23 %（39/129），ctDNA 中tp53 的 突 變 率 為54.76%（92/168）。

2.2 tp53 基因突變特征

基于目標序列的二代測序結(jié)果顯示，92 例患者（54.76 %）ctDNA 中檢出至少1 個突變，25 例患者（14.88%）檢出至少2 個突變，突變頻率最高的類型分別為p.R213*（4.17%）、p.R248Q（3.57%）、p.R273H（2.98 %）、p.Y220C（2.38 %）和p.R175H（1.79 %）（表1）。突變類型分別為錯義突變（92/168，54.76%）、移碼突變（29/168，17.26%）和無義突變（25/168，14.88%）。突變分布不均，75%（126/168） 的突變聚集在外顯子5 ～8 中，大部分分布在編碼DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列內(nèi)。 外顯子4（17/168，10.12%）、9（4/168，2.38%）和10（10/168，5.95%）也有突變，其余突變位于外顯子3及其間隔序列中。

39 例患者（30.23%）組織中檢出至少1 個突變，15 例（11.63%）患者檢出至少2 個突變，突變頻率最高的類型分別為p.R213*（8.53%）、p.R248Q（6.98%）、p.R273H（4.65%）、p.Y220C（3.10%）（表1）。 錯義突變、 移碼突變和無義突變占比分別為62.02 %（80/129）、23.26%（30/129）和16.28%（21/129），突變分布主要集中在外顯子5 ～8 中（81.40%，105/129）。

表1 tp53 基因突變類型與頻率 例（%）Tab.1 Type and frequency of tp53 gene mutationcases（%）

2.3 胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變的一致性分析

129 例患者胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變的一致性為79.84 %（103/129）（Kappa = 0.325，P ＜0.001），靈敏度為79.59%（39/49），特異度為80.00%（64/80）。 見表2。

表2 胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 的一致性分析例（%）Tab. 2 Correspondence analysis between tissue and ctDNA detection of tp53 in pancreatic cancer cases（%）

2.4 影響胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的相關(guān)因素

由于胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變存在一定的不一致性，因此進行了單因素分析。 結(jié)果顯示，年齡、腫瘤最大直徑、分化程度及臨床分期是胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的影響因素（P ＜0.05）。 見表3。

表3 影響胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的單因素分析Tab. 3 Univariate factor analysis on consistency of tp53 gene mutation between pancreatic cancer tissue and ctDNA detection

2.5 胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的多因素回歸分析

以胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變結(jié)果是否一致為因變量（是=0，否=1），以表3 中差異具有統(tǒng)計學意義的影響因素為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析。 結(jié)果顯示：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化為胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的獨立危險因素（P ＜0.05）。 見表4。

表4 胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的多因素回歸分析Tab.4 Multivariate factor analysis on consistency of tp53 gene mutation between pancreatic cancer tissue and ctDNA detection

3 討論

高通量測序技術(shù)能覆蓋較多的基因位點，并且具有較高的靈敏度和特異度，在臨床腫瘤診斷中顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢[9]。 胰腺癌解剖部位特殊，腫瘤組織不易獲取，采用傳統(tǒng)活檢進行病理診斷具有一定的挑戰(zhàn)。 而ctDNA 僅來源于腫瘤細胞，可在患者血液、尿液或唾液中獲得[10]，取樣操作簡單并可多次重復取樣，在臨床檢測早期疾病、監(jiān)測腫瘤基因圖譜等方面發(fā)揮重要作用。 然而ctDNA 由于其片段化特征、檢測技術(shù)的限制及時空異質(zhì)性，易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[11]，因此探討胰腺癌患者癌組織與ctDNA 基因突變的一致性，對于確定ctDNA 檢測在胰腺癌臨床診療中的作用具有重要意義。

Li H 等[12]通過分析胰腺癌患者血液樣本ctDNA序列探討了ctDNA 在胰腺癌中的應用價值， 結(jié)果顯示68.2 %患者從ctDNA 序列中檢測出一種基因突變， 其與組織樣本中基因突變頻率具有較高的一致性，發(fā)生突變最多的基因分別為鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）和tp53。 筆者研究結(jié)果顯示， 胰腺癌組織標本中tp53 突變率為30.23%，ctDNA 中tp53 的突變率為54.76%，提示胰腺癌患者ctDNA 中tp53 的突變率更高， 分析可能與腫瘤的發(fā)展導致腫瘤組織局部供血不足、腫瘤細胞被巨噬細胞吞噬后ctDNA 含量顯著增加有關(guān)[13]。 此外，筆者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變發(fā)生在基因編碼DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，大部分為錯義突變，tp53 突變位于編碼tp53 的DNA 結(jié)合區(qū)域， 突變類型以p.R248Q （3.57 %）、p.R273H（2.98%）、p.Y220C（2.38%）為主。 胰腺癌患者癌組織與ctDNA 基因突變的一致性為79.84%，提示二者具有一定的不一致性。 導致組織與ctDNA 檢測不一致的因素較多，ctDNA 為小片段DNA，其在血液中的濃度較低[14]；此外，腫瘤的異質(zhì)性也可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[15]。

通過分析檢測結(jié)果一致和不一致胰腺癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，不一致組患者年齡更大、腫瘤最大直徑＞5 cm 的比例更低、 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期和高分化比例更高。 既往研究結(jié)果顯示[16]，腫瘤負荷增大將侵犯周圍組織和血管，導致癌細胞遠處轉(zhuǎn)移，增加外周血中凋亡癌細胞數(shù)量， 從而提高與組織檢測的一致性。 進一步通過多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化為組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變一致性的獨立危險因素， 提示胰腺癌組織與ctDNA 檢測tp53 基因突變的一致性與腫瘤情況密切相關(guān)，分化程度越低、臨床分期越高的腫瘤，其更容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，從而增加血液中腫瘤ctDNA 分布[17]，提高檢出的一致性。

綜上所述， 胰腺癌患者ctDNA 與癌組織檢測tp53 基因突變情況存在一定的差異性，臨床分期和分化程度是影響一致性的重要因素。但筆者研究仍存在一定的局限性，首先，研究對象的選擇來源于單個中心，且病例數(shù)較少；其次，缺乏隨訪調(diào)查，未進行隨訪調(diào)查，缺乏對檢出一致性結(jié)果不同患者臨床療效及預后情況的追蹤，因此仍需進一步擴大樣本量，進行前瞻性、 多中心的研究探討ctDNA 檢測在胰腺癌中的應用價值。