王春暉,潘 卓,唐忠明

王春暉,潘卓,湖州市第一人民醫(yī)院外科 浙江省湖州市 313000

唐忠明,湖州市第一人民醫(yī)院消化科 浙江省湖州市 313000

0 引言

急性胰腺炎是胰腺的一種炎癥性疾病,輕癥以胰腺水腫和出血為主,重癥可出現(xiàn)組織壞死,預后較差[1,2].長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子,廣泛參與細胞分化、增殖、凋亡和炎癥等調控過程[3,4].如lncR-RGD1566401的上調表達能夠促進大鼠急性胰腺炎AR42J細胞凋亡[5].LncRNA漿細胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)可通過調控微小RNA(miR)-30a-5p表達,促進胰腺腺泡細胞自噬,加重急性胰腺炎[6].LncRNA核內富集轉錄物1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)下調可通過海綿miR-365a-3p緩解雨蛙肽誘導的腺泡細胞炎癥損傷[7].

已有研究報道lncRNA H19在急性胰腺炎中異常表達,與疾病嚴重程度有關[8].但lncRNA H19在胰腺腺泡細胞損傷中的作用及機制還有待進一步探究.本研究利用雨蛙肽誘導胰腺AR42J細胞構建體外急性胰腺炎細胞模型,以期揭示lncRNA H19在細胞損傷中的調控作用機制.

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺AR42J細胞購自中科院上海細胞庫;改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基購自美國Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Promega公司;雨蛙肽購自美國BD公司;脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;TRIzol試劑購自大連寶生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒購自美國Cell Signaling公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自北京天根生化科技公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理: 胰腺AR42J細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2條件中,待細胞融合至60%-90%時,更換含有濃度100 nM雨蛙肽的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,建立胰腺損傷細胞模型.

細胞轉染和分組: 使用Lipofectamine 2000轉染試劑,根據(jù)試劑說明書,分別將終濃度為30 nM-50 nM的si-NC、si-H19、miR-NC、miR-30a-5p、si-H19與anti-miRNC、si-H19與anti-miR-30a-5p轉染AR42J細胞.轉染48 h后,更換常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后再更換含100 nM雨蛙肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,根據(jù)轉染基因不同,分別將細胞記為雨蛙肽+si-NC組、雨蛙肽+si-H19組、雨蛙肽+miRNC組、雨蛙肽+miR-30a-5p組、雨蛙肽+si-H19+antimiR-NC組、雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組.

1.2.2 RT-qPCR檢測H19和miR-30a-5p表達水平: 采用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA,反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA.使用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進行RT-PCR反應.循環(huán)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán),60 ℃延長5 min.2-ΔΔCt方法計算H19和miR-30a-5p相對表達水平.

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡: 各組細胞培養(yǎng)48 h后用預冷的PBS漂洗2次,與500 μL的結合緩沖液混勻.先加入10 μL的Annexin V-FITC,再加入5 μL的PI,混勻后避光孵育10 min.用流式細胞儀檢測細胞凋亡率.

1.2.4 ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平: 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平,按照試劑盒附帶的說明書進行實驗步驟.

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗檢測H19和miR-30a-5p的靶向關系: 將含有miR-30a-5p結合位點的H19野生型(wildtype,WT)序列或突變型(mutant-type,MUT)序列克隆到熒光素酶報告質粒,構建成熒光素酶報告基因載體WTH19和MUT-H19.將miR-30a-5p、miR-NC分別與WT-H19或者MUT-H19共轉染至雨蛙肽誘導AR42J細胞,測定各組細胞的熒光素酶活性.并將si-NC、si-H19、pcDNANC、pcDNA-H19分別轉染至雨蛙肽誘導AR42J細胞中,參照RT-qPCR步驟檢測細胞miR-30a-5p表達水平.

統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料用平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,兩組比較行t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗.統(tǒng)計學顯著性用aP＜0.05表示,同一表中另一套P值,則用cP＜0.05.

2 結果

2.1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽誘導的AR42J細胞中的表達 與正常胰腺細胞比較,雨蛙肽誘導損傷的胰腺炎細胞中H19表達水平顯著升高,miR-30a-5p表達水平顯著降低(P＜0.05).見表1.

表1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽誘導的AR42J細胞中的表達(mean±SD,n=9)

2.2 低表達H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞凋亡、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組H19表達水平顯著降低;細胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)-I蛋白表達顯著降低、LC3-II蛋白表達顯著升高(P＜0.05).見表2和圖1.

圖1 敲低H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測炎癥因子的分泌;B: 蛋白質印跡檢測蛋白的表達.雨蛙肽+si-NC組 vs 雨蛙肽+si-H19組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表2 敲低H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞存活的影響(mean±SD,n=9)

2.3 高表達miR-30a-5p對雨蛙肽誘導的AR42J細胞存活、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+miR-NC組比較,雨蛙肽+miR-30a-5p組miR-30a-5p表達水平顯著升高;細胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高(P＜0.05).見表3和圖2.

圖2 高表達miR-30a-5p對雨蛙肽誘導的AR42J細胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測炎癥因子的分泌;B: 蛋白質印跡檢測蛋白的表達.雨蛙肽+miR-NC組 vs 雨蛙肽+miR-30a-5p組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ:微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表3 高表達miR-30a-5p對雨蛙肽誘導的AR42J細胞存活影響(mean±SD,n=9)

2.4 H19靶向miR-30a-5p表達 LncBase Predicted v.2預測H19和miR-30a-5p之間存在結合位點,見圖3.雙熒光素酶報告顯示,與轉染miR-NC比較,轉染miR-30a-5p可降低WT-H19的相對熒光素酶活性(P＜0.05),而對MUT-H19的相對熒光素酶活性無顯著影響(P＞0.05),見表4.

圖3 H19和miR-30a-5p靶向結合圖.LncBase Predicted v.2預測H19和miR-30a-5p之間存在結合位點.WT-H19: H19野生型;MUT-H19:H19突變型.

表4 雙熒光素酶活性檢測(mean±SD,n=9)

RT-qPCR檢測顯示,與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組細胞miR-30a-5p表達水平顯著升高(P＜0.05);與雨蛙肽+pcDNA-NC組比較,雨蛙肽+pcDNA-H19組細胞miR-30a-5p表達水平顯著降低(P＜0.05),見表5.

表5 qRT-PCR檢測miR-30a-5p表達(mean±SD,n=9)

2.5 低表達miR-30a-5p可以逆轉低表達H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞凋亡、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比較,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p表達顯著降低;細胞存活率顯著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高;LC3-Ⅰ蛋白表達顯著升高、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低(P＜0.05).見表6和圖4.

圖4 低表達miR-30a-5p可以逆轉低表達H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測炎癥因子的分泌;B:蛋白質印跡檢測蛋白的表達.雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC組 vs 雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表6 低表達miR-30a-5p可以逆轉低表達H19對雨蛙肽誘導的AR42J細胞存活的影響(mean±SD,n=9)

3 討論

急性胰腺炎是一種比較常見的消化系統(tǒng)疾病,成年人發(fā)病概率比較高,根據(jù)病理分型可分為間質水腫型和壞死型兩種.引起該病的病因非常多,在我國最常見的是膽石癥、酒精和高脂血癥[9,10].

LncRNA H19在急性胰腺炎患者的血清中表達升高,且對于急性胰腺炎診斷和嚴重程度的預判具有一定臨床價值[11].重癥急性胰腺炎大鼠胰腺中miR-30a-5p表達顯著降低[12].本實驗研究發(fā)現(xiàn),與正常胰腺細胞比較,雨蛙肽誘導急性胰腺炎細胞中H19表達水平顯著升高,miR-30a-5p表達水平顯著降低.此外,有研究表明沉默lncRNA H19可減少雨蛙素誘導的胰腺腺泡細胞凋亡,其可能成為治療急性胰腺炎的潛在有效靶點[13].本實驗研究表明,與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組H19表達水平顯著降低;細胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高.

miRNA是一類長度約19-22個核苷酸的非編碼RNA,是重要的轉錄后調控因子[14,15].已經(jīng)有研究報道,miR-155抑制劑能夠降低重癥急性胰腺炎大鼠炎癥因子,減輕重癥急性胰腺炎急性肺損傷[16].急性胰腺炎患者外周血miR-16和miR-192表達及其與病情嚴重程度密切相關[17].miR-7a-5p可促進急性胰腺炎腺泡細胞凋亡并降低細胞增殖能力[18].本實驗研究結果,與雨蛙肽+miRNC組比較,雨蛙肽+miR-30a-5p組miR-30a-5p表達水平顯著升高;細胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高.

本實驗研究顯示,與雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比較,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p表達顯著降低;細胞存活率顯著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高;LC3-Ⅰ蛋白表達顯著升高、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低.有類似的研究報道與本實驗一致.LncRNA β-1,3半乳糖基轉移酶-反義5(β-1,3-galactosyltransferase 5-AS1,B3GALT5-AS1)靶向miR-361-3p調節(jié)大鼠胰腺腺泡細胞增殖及凋亡[19].miR-141-3p靶向調控CUE結構域蛋白2(CUE domain-containing protein 2,CUEDC2)基因影響雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷[20].miR-7靶向特異性蛋白3(specific protein 3,Sp3)影響急性胰腺炎腺泡細胞增殖和凋亡[21].

4 結論

綜上所述,下調H19靶向上調miR-30a-5p抑制雨蛙肽誘導的急性胰腺炎細胞凋亡、炎癥因子分泌和自噬.

文章亮點

實驗背景

急性胰腺炎是一種死亡率較高的嚴重疾病,嚴重威脅著人類健康.探究影響急性胰腺炎進程的分子機制,有望為其治療提供理論依據(jù).

實驗動機

許多長鏈非編碼RNA被證實參與了急性胰腺炎進程,但是H19在急性胰腺炎進程中的作用和潛在分子機制值得進一步揭示.對H19作用的探究可能為其成為急性胰腺炎的治療靶點提供證據(jù).

實驗目標

本研究希望通過揭示調控急性胰腺炎進程的潛在分子機制,為急性胰腺炎的治療提供有效分子靶點.

實驗方法

雨蛙肽誘導建立胰腺損傷細胞模型.通過細胞計數(shù)實驗和流式細胞術檢測細胞活力和凋亡;酶聯(lián)免疫吸附實驗評估炎癥因子的分泌;蛋白質印跡法檢測細胞自噬相關蛋白表達.雙熒光素酶實驗檢測細胞中H19和miR-30a-5p靶向結合關系.

實驗結果

H19敲低可以改善雨蛙肽誘導的急性胰腺炎細胞凋亡、炎癥和自噬.H19可以靶向miR-30a-5p,且其敲低對雨蛙肽誘導的急性胰腺炎細胞損傷的影響可以被miR-30a-5p抑制劑所逆轉.

實驗結論

H19通過靶向miR-30a-5p促進雨蛙肽誘導的急性胰腺炎細胞損傷,表明其可能對急性胰腺炎進程有促進作用.

展望前景

H19可能是急性胰腺炎治療的潛在分子靶點.未來可以在臨床水平以及動物水平進一步證實H19/miR-30a-5p調控急性胰腺炎進程的結論.